PCR荧光探针法检测叶酸三项代谢能力

吴 雪 王亚楠 毛冰昆 卢克新

滨州医学院附属医院产科，山东滨州 256600

叶酸缺乏是新生儿出生缺陷、自然流产、妊娠期贫血、妊娠期高血压疾病的高危因素。孕妇对叶酸的需求量是普通人群的4倍[1]。随着基因检测技术的发展，认识到叶酸代谢相关基因多态性会导致个体叶酸代谢能力存在差异。根据个体叶酸代谢基因多态性位点的基因型，评估育龄妇女叶酸代谢障碍的风险情况，指导其合理补充叶酸，是改善不良孕产史妇女妊娠结局、降低出生缺陷风险的有效措施。山东英盛生物技术有限公司研制开发的叶酸三项代谢能力检测试剂盒（PCR荧光探针法），用于定性检测人类外周血中叶酸代谢相关基因（包括MTHFR677、MTHFR1298、MTRR66）位点的碱基突变，以期辅助临床医生评估患者叶酸代谢障碍风险程度，为育龄期女性科学增补叶酸进行量化指导，增强个性化补充的依从性。此实验依托滨州医学院附属医院、潍坊市人民医院、烟台毓璜顶医院以证明其临床应用中的安全性和有效性。三家医院共纳入1050例受试者，现报道滨州医学院附属医院研究的350例患者研究结果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年7—12月于滨州医学院附属医院就诊并签署受试者知情同意书的女性患者350例作为研究对象，平均年龄（29.30±4.27）岁，根据既往妊娠史分为正常组（无不良妊娠史）318例和研究组（有不良妊娠史）32例，正常组纳入标准：①首次孕育，确认本次妊娠为宫内活胎且胎儿发育正常；②既往孕育无不良孕产史；③无孕育史。研究组纳入标准：①有自然流产史；②有胚胎停育史；③有神经管畸形胎儿孕史；④有染色体异常胎儿孕史。排除标准：①3个月内参加过临床试验；②有精神障碍无法配合完成；③因各种原因受试者自动退出或不能完成者；④排除其他遗传性疾病。本研究经滨州医学院附属医院伦理委员会批准（伦理号：2018-007-03）。

1.2 实验产品与检测仪器

叶酸三项代谢能力检测试剂盒（PCR荧光探针法）（山东英盛生物技术有限公司，1811001、190701）；金标准：sanger测序法（生工生物工程上海股份有限公司）；检测仪器：实时荧光定量PCR仪（Life Technologies Holdings Pte Ltd，型号：ABI 7500）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 受试者采集两份静脉血1.5～2.0 ml，置于EDTA抗凝管中。

1.3.2 样本处理 取200μl EDTA抗凝血加入600 μl双蒸水，振荡混匀，室温放置10 min，12 000 rpm离心5 min，弃上清；加入200 μl DNA提取液，100℃水浴8 min；12 000 rpm离心5 min，取上清用于检测。

1.3.3 样本检测及PCR扩增 将2 μl待测DNA模板、空白对照、阴性质控、阳性质控加入含有23 μl PCR反应液的PCR反应管内。按照实验仪器说明书进行PCR扩增。

采用TaqMan探针标记的荧光PCR技术，针对靶基因（MTHFR基因C677T、A1298C，MTRR基因A66G）设计高度特异的引物和探针。每种探针的5’端为报告荧光基团，3’端为淬灭荧光基团，通过所检测到的荧光信号类型，判断样本是否存在相应突变位点。将另一份样本送生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 实验产品基因型和对照方法检测结果一致性分析

叶酸代谢基因相关位点MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G与测序法之间的一致率分别为100.00%、99.43%、98.84%；一致率的95%CI为98.93～100.00、0.93～1.00、97.05～99.68；一致性检验的Kappa值为1.000、0.972、0.979；Kappa检验P值均<0.0001。见表1～3。

表1 MTHFR基因C677T位点检测结果一致性列表（测序法诊断基因型）

表2 MTHFR基因A1298C位点检测结果一致性列表（测序法诊断基因型）

表3 MTRR基因A66G位点检测结果一致性列表（测序法诊断基因型）

统计结果均显示试验产品与对照方法检测结果的Kappa值均>0.95，证明两种方法所测的检测结果一致性极好，对Kappa值做假设检验，P值均<0.0001，证明两种方法一致性由随机因素造成的可能性较小。

2.2 叶酸代谢障碍相关基因多态性与女性不良孕产史相关性讨论

单个基因位点比较，研究组与正常组基因型分布比较，差异均无统计学意义（P> 0.05）。见表4～6。

表4 MTHFR基因C677T位点

表5 MTHFR基因A1298C位点

表6 MTRR基因A66G位点

在32例有不良孕产史的受试者中，因C677T位点突变而提示风险的仅有16例，占不良孕产史受试者总数的50.00%。综合考虑三个位点（包括单位点突变和多位点突变），提示叶酸代谢风险的受试者有29例，占所有不良孕史受试者的90.63%。

3 讨论

我国是出生缺陷高发国家，在现有的8000多万残疾人中，70%是由出生缺陷所致[2]。叶酸参与多种物质的合成，影响叶酸代谢水平的酶包括5，10-亚甲基四氢叶酸叶酸还原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）。MTHFR常见基因多态性有C667T和A1298C两个位点，该两处位点的突变都将引起酶活性改变，其中两个位点双突变时酶活性降到最低，仅为野生型15%[3]。根据闵爱萍等[4-5]研究，MTHFR基因C677T、A1298C，MTRR基因A66G突变是导致体内同型半胱氨酸升高的独立遗传决定因素，同时MTHFR基因A1298C位点的突变与MTHFR基因C677T、MTRR基因A66G位点突变对体内同型半胱氨酸水平升高具有联合作用。孕前3个月补充叶酸，可以降低胎儿神经管发育缺陷，从而降低无脑儿、裂脑儿的发生率[6-7]。多数NTDs可以通过服用叶酸达到预防作用[8]，2009年6月21日原卫生部启动增补叶酸预防神经管缺陷项目[9]，建议无高危因素的育龄期妇女孕前3个月口服0.4～0.8 mg叶酸，有神经管缺陷生育史的妇女建议至少孕前1个月开始每日增补4 mg叶酸。目前育龄夫妇已经意识到孕前应用叶酸或叶酸复合营养素有助于预防神经发育相关缺陷疾病[10-11]。

目前，检测MTHFR和MTRR基因多态性的方法包括Taqman-MGB技术、高分辨溶解曲线法、PCR-RFLP法、引物扩增阻滞突变系统结合侧向流层[12-15]。本研究通过PCR荧光探针法开发了一种快速检测MTHFR、MTRR基因多态性的检测方法。本研究组所研制的检测体系的检测结果与验证方法一致。PCR荧光探针法具备检测快速、操作简单、样本要求低的特点，产品适用于具备双通道检测能力的多种型号PCR仪。可在临床上广泛使用。

有研究[16]指出MTHFR和MTRR是不良妊娠发生的独立危险因素。综合考虑三个位点联合应用可更好地预测不良妊娠结局，因此在孕前进行基因分析并根据检测结果科学补充叶酸是降低不良妊娠发生重要手段。