浒苔多糖降解菌的筛选及其产物对黄豆种子萌发及生长的影响

耿 建，任召珍，丛懿洁，于佳弘，张玲俐

（1. 威海海洋职业学院，山东 威海 264300；2. 海洋经济藻类开发与利用工程技术协同创新中心，山东 威海 264300）

0 引言

全球气温上升、海水富营养化，导致浒苔在温度合适时迅速生长繁殖。2007 年以来，中国黄海连续15 年暴发以浒苔为肇事藻种的绿潮灾害，对该海域和沿岸地区的生态环境、滨海景观、旅游和海水养殖业造成了严重影响。浒苔是归属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属的一种大型藻类，浒苔在全球范围内有20 余亚种，分布较为广泛。研究表明，浒苔细胞壁的主要成分是具有复杂结构的浒苔多糖[1]，浒苔多糖作为浒苔的主要活性成分，具有多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和降血脂等，但是由于分子量比较大，浒苔多糖具有溶解性差、生物利用率低等缺陷，极大地限制了浒苔多糖资源的高值化开发和利用。浒苔多糖的化学组成较为复杂，齐晓辉[2]研究了来源于缘管浒苔、青岛绿潮浒苔及厦门条浒苔的浒苔多糖的化学组成。研究发现，绿潮浒苔多糖主要由鼠李糖构成，含有少量的半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸；厦门条浒苔多糖则主要由阿拉伯糖和半乳糖组成；此外，还含有少量的鼠李糖和微量的岩藻糖、木糖、甘露糖和葡萄糖等成分；青岛绿潮浒苔多糖则主要由鼠李糖组成，含有少量的葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖和甘露糖[3-5]。试验所用浒苔取自青岛绿潮浒苔，从浒苔的附生菌中筛选出能够高效降解浒苔多糖的菌株，研究了浒苔降解产物对黄豆种子萌发及生长的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料来源

浒苔，采自山东乳山银滩区域；黄豆，普通市售黄豆种子。

1.1.2 培养基制备

（1） 富集培养基（g/100 mL）。浒苔10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠1.5 g，维氏盐溶液5 mL，pH 值7.0～7.5。（维氏盐溶液：K2HPO4·3H2O 6.50 g，Mg-SO4·7H2O 2.50 g，NaCl 2.50 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.04 g，蒸馏水1 000 mL。）

（2） 分离培养基（g/100 mL）。蛋白胨0.5 g，酵母粉0.1 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠1.5 g，维氏盐溶液5 mL，琼脂1.5 g，pH 值7.0～7.5。

（3） 筛选培养基（g/100 mL）。浒苔多糖1.5 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠1.5 g，维氏盐溶液5 mL，琼脂1.5 g，pH 值7.0～7.5。

1.2 试验方法

1.2.1 浒苔多糖提取

准确称取100 g 干燥的浒苔进行超微粉碎过筛，加入1 L 体积比1∶1 的二氯甲烷和丙酮混合溶液，抽滤后于65 ℃下干燥，使用3 L 蒸馏水热水提取7 h，离心，取上清液。加入蛋白酶K 于37 ℃条件下反应24 h，100 ℃下煮10 min，离心，取上清液。向上清液中加入 4 倍体积的95%的乙醇，置于4 ℃冰箱冷藏。将沉淀的浒苔多糖用丙酮洗涤，使用乙醇洗涤，最后进行烘干，研磨。

1.2.2 菌株筛选

（1） 浒苔降解菌株富集。称取10 g 新鲜浒苔，置于装有90 mL 富集培养基的三角烧瓶中，于30 ℃条件下以转速180 r/min 培养，观察培养液浑浊度及浒苔降解情况，培养3 d 后取10 mL 培养液于新的富集培养基中，继续培养至浑浊。

（2） 菌株分离与筛选。将富集后的菌液梯度稀释后涂布与分离培养基上，培养48 h。选取菌落形态不同的菌进行纯化后点种与筛选培养基中，于30 ℃条件下培养48 h。利用高碘酸透明圈法筛选浒苔多糖降解菌。

1.2.3 菌株鉴定

（1） 形态学鉴定。采用平板划线法将菌株接种到LB 固体培养基中，于30 ℃条件下培养48 h 后观察菌落形态；将其进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察菌体形态。

（2） 分子生物学鉴定。采用Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒提取DNA，采用通用引物，上游引物7F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'），下游引物1540R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'），以菌液DNA 为模板，进行PCR 反应。将上述的PCR产物用凝胶回收试剂盒进行回收后，送至上海生工生物工程股份有限公司测序，使用NCBI 在线软件BLAST 与已知微生物的16S rDNA 进行相似性分析。

1.2.4 大豆种子萌发及生长测定

（1） 浒苔多糖降解液制备。将菌株接种于含有1.5%浒苔多糖的培养液中，于30 ℃条件下培养48 h，然后用0.22 μm 滤膜过滤除菌，去除菌株菌体，得到浒苔多糖降解液。

（2） 试验分组。试验采取随机组设计，每组30 粒种子，重复3 次，设计9 个处理。处理1：浒苔多糖发酵液原液；处理2：浒苔多糖发酵液清水稀释100 倍；处理3：浒苔多糖发酵液清水稀释500 倍；处理4：浒苔多糖发酵液清水稀释1 000 倍；处理5：1.5%的浒苔多糖液；处理6：1.5%的浒苔多糖液清水稀释100 倍；处理7：1.5%的浒苔多糖液清水稀释500 倍；处理8：1.5%的浒苔多糖液清水稀释1 000 倍；处理9：清水对照。

（3） 种子生物特性测定。将种子放入清水中浸泡过夜，挑选大小相似的种子随机分9 组，放入垫有纱布的托盘中，每天喷洒处理液2 次，48 h 后计算发芽率，5 d 后测量种子芽长及干质量。

1.2.5 数据处理

采用Microsoft excel 对检测数据统计并分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

浒苔附生菌经过富集后，在分离培养基中得到8 株不同的菌株，将其点种与筛选培养基中，只得到2 个菌株，经过高碘酸透明圈法筛选只有1 株菌株出现了明显的透明圈，且透明圈直径超过2 cm。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态学鉴定

在LB 固体培养基上可观察到，菌落呈乳白色，不透明，圆形边缘有缺刻，直径大概1 mm，表面光滑湿润。经革兰氏染色可以看出该菌株为革兰氏阳性细菌，形态呈弧状，单个排列。

2.2.2 分子生物学鉴定

经过PCR 扩增后，菌株16SrDNA长度为1 450 bp，经过blast 对比发现该菌株与Vibrio diabolicus 相似度达到99.66%，推测该菌株为Vibrio diabolicus（魔鬼弧菌）。

2.3 浒苔多糖降解产物对黄豆种子萌发及生长的影响

2.3.1 不同浒苔多糖降解液对种子萌发的影响

浒苔多糖降解产物对黄豆种子发芽率的影响见图1。

图1 浒苔多糖降解产物对黄豆种子发芽率的影响

由图1 可知，处理1 和处理5 其发芽率较处理9（对照组） 低8.9%，其他处理组黄豆种子发芽率与对照组比没有显著差别。说明高浓度浒苔多糖培养液不利于黄豆种子发芽，低浓度的浒苔多糖对种子发芽率影响不大。

2.3.2 不同浒苔多糖降解液对黄豆种子芽长增长的影响

浒苔多糖降解液对黄豆种子芽长增长的影响见图2。

图2 浒苔多糖降解液对黄豆种子芽长增长的影响

由图2 可知，处理6 的芽长较处理9（对照组）长8.0%，处理组2 的芽长较处理9（对照组） 长4.8%。说明适宜浓度的浒苔多糖和浒苔多糖降解液均能够促进黄豆种子芽的生长，浒苔多糖降解后促进作用更加明显。

2.3.3 不同浒苔多糖降解液对种子生长量的影响

对种子生长量的影响见图3。

图3 浒苔多糖降解液对种子生长量的影响

由图3 可知，处理7 的种子干质量较处理9（对照组） 增长22.7%，处理6 的种子干质量较处理9（对照组） 增长18.2%。处理组1～4 的种子干质量与处理9（对照组） 差距不明显。说明浒苔多糖不能被黄豆种子很好地利用，但被降解后的浒苔多糖能够被黄豆种子较好地吸收利用。

3 结论

浒苔这一藻类资源非常丰富，浒苔中浒苔多糖的含量高达50%，浒苔多糖具有降血糖、提高免疫力、抗肿瘤等多种生物活性，由于其多糖分子量较大，浒苔多糖在应用方面受到了极大的限制。将大分子的浒苔多糖降解为低分子量的寡糖是当前研究的热点。目前，将大分子的浒苔多糖降解为小分子的糖的方法主要有物理法、化学法、酶法。化学法降解浒苔多糖，高玉杰等人[4]利用三氟乙酸（TFA）对浒苔多糖进行降解，用于制备低分子量的浒苔多糖。有研究利用TFA 和硝酸对浒苔多糖进行降解，并对降解的工艺条件进行了优化。物理法降解浒苔多糖，由于物理法降解多糖的条件较为剧烈，可能会对寡糖的结构造成破坏。Li Bing 等人[5]利用微波辅助的方法降解浒苔多糖，由于微波作用的非特异性，降解得到的产物分子量分布差异较大，从3.1 kU 到446.5 kU 均有分布。酶降解法是利用酶作为一种特殊的生物催化剂，具有较强的底物和产物专一性，可选择性酶解特定的糖苷键得到特定寡聚糖，还不造成环境污染，因此寻找一种活力高、稳定性强的海藻多糖降解酶成为了目前浒苔利用性研究的热点。试验从浒苔附生菌中筛选出一株能够高效降解浒苔多糖的菌株，经分子学鉴定推测该菌株为Vibrio diabolicus。通过不同浓度的浒苔多糖降解液处理黄豆种子发现适宜浓度浒苔多糖降解液对促进黄豆种子生长有明显作用，而对种子萌发作用不明显。高浓度浒苔多糖培养液会抑制黄豆种子萌发及生长，所以在浒苔多糖降解液的应用中应注意浓度适宜。