广西农村养蚕生产应用的10种消毒剂对家蚕主要病原的消毒效果

陆方苗 罗红尚 韦永享 覃向平 马靖羽 蒋师东 何 骥 肖 潇 黄旭华 韦善教

(1广西壮族自治区蚕业技术推广站, 广西南宁 530007; 2环江毛南族自治县农业农村局, 广西河池 547100; 3河池市绿色农业发展中心, 广西河池 547000)

消毒是养蚕生产中杀灭环境病原微生物,控制各种蚕病发生的重要措施,蚕药是养蚕生产应用的重要物资[1]。长期以来,养蚕生产中主要使用漂白粉、次氯酸钠、强氯精(三氯异氰尿酸)和优氯净(二氯异氰尿酸钠)等含氯制剂以及福尔马林等醛制剂进行蚕业消毒[2]。随着科技的发展,人类医疗卫生、畜牧养殖等方面研发应用的消毒剂层出不穷,部分消毒剂逐渐推广到蚕业生产中进行养蚕消毒,如一些季铵盐类(表面活性剂)、醛制剂和碘类等[3]。家蚕传染性病原种类多,有病毒、真菌、细菌、原虫等病原体,而且有的还是比较难以杀灭的病原体,如家蚕核型多角体病毒(BombyxmoriNuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)和家蚕质型多角体病毒(BombyxmoriCytoplasmic Polyhedrosis Virus, BmCPV)有蛋白质多角体外壳保护,家蚕微孢子虫也具有几丁质外壳保护,而家蚕真菌的分生孢子、细菌的芽孢也具有特殊的防御能力[4],这些病原微生物对理化因子和环境因子都有一定的抵抗力,特别是包埋于多角体蛋白中的BmNPV和BmCPV病毒粒子在失水、冰冻、酶降解、酸和去污剂处理条件下仍能够存活[5],只有在pH≥10.5的强碱性条件下将病毒(BmNPV和BmCPV)的多角体蛋白融解后才能将病毒粒子从蛋白多角体中释放出来加以杀灭[6]。另外,随着工厂化养蚕应用的机器设备和铁制设施越来越多,以及农村生活条件改善使用的电器也越来越多,使蚕农在养蚕生产中对强腐蚀性消毒剂避而远之。因此,养蚕生产中使用的消毒剂的有效性、酸碱度及腐蚀性影响着它们的使用范围。目前,农村养蚕生产中使用的消毒剂种类繁多,而这些消毒剂是否适合应用于养蚕生产还有待深入研究。为此,本研究从广西蚕区蚕药市场上分别筛选含醛、含碘、季铵盐、含氯和其他类的消毒剂,每种类选择1～3种(共10种),对这些消毒剂的有效性、酸碱性和腐蚀性等性能进行比较试验,以期为养蚕生产选择合适的蚕药并为有效消毒防控蚕病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试消毒剂 试验药物从广西蚕区蚕药市场上选择含醛类的戊二醛、福尔马林,含碘类的聚维酮碘、癸甲丙二醇氯铵复合碘,季铵盐类的苯扎溴铵、癸甲溴铵、月苄三甲氯铵,含氯类的优氯净、漂白粉精及其他类消毒剂二氧化氯等10种消毒剂。各种消毒剂的生产厂家及生产使用浓度详见表1。

表1 试验应用的10种消毒剂

1.1.2 供试家蚕品种 家蚕品种为932,2龄,由广西壮族自治区蚕业技术推广站提供。

1.1.3 供试培养基 LB营养琼脂培养基,北京奥博星生物技术有限公司产品;LB肉汤液体培养基,北京奥博星生物技术有限公司产品;PDA培养基,SOLARBIO公司产品。

1.1.4 供试病原菌 试验用病原菌为家蚕灵菌(Serratinmarcescens)、家蚕白僵菌(Beauveriabassiana)、BmNPV和家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,Nb),均由广西壮族自治区蚕业技术推广站保存和提供。

1.1.5 主要仪器设备 SW-CJ-1FD型超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司产品;MODEL ECLIPSE Ci-L型生物显微镜, 日本NIKON CORPORATION TOKYO公司产品;3k15型台式高速冷冻离心机,SIGMA公司产品;CR60型立式自动压力蒸汽灭菌器, 致微(厦门)仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基准备 各称取LB营养琼脂培养基32 g、LB肉汤液体培养基20 g、PDA培养基38 g,分别加入1 000 mL蒸馏水中,加热煮沸溶解,分装,LB营养琼脂培养基和LB肉汤液体培养基经121 ℃高压灭菌15 min后备用,PDA培养基经121 ℃高压灭菌20 min后备用。

1.2.2 病原菌的配制 (1)灵菌的配制。从灵菌平板上挑取病原菌接种到LB营养琼脂培养基上,37 ℃培养24 h,挑取单菌落接种到LB肉汤液体培养基中,37 ℃、200 r/min培养24 h,配成浓度约为5.0×108个/mL的菌体悬浮液。(2)白僵菌的配制。从白僵菌平板上挑取白僵菌分生孢子接种到PDA培养基上,28 ℃培养10 d,挑取分生孢子加入到无菌水中,配成浓度为1.5×108个/mL的分生孢子悬浮液。(3)BmNPV的配制。取家蚕血液型脓病病蚕血液,经离心纯化后用无菌水配成浓度为1.5×107个多角体/mL的多角体悬浮液。(4)Nb的配制。取家蚕微粒子病病蚕,研磨、过滤、离心纯化后,用无菌水配成浓度为1.5×107个孢子/mL的孢子悬浮液。

1.2.3 各种消毒剂对不同家蚕病原体的杀灭试验 (1)对家蚕灵菌败血病病原体的杀灭试验。采用悬浮液法[7]调查10种消毒剂溶液不同时间、不同浓度杀灭家蚕灵菌的情况。利用移液枪取200 μL的5.0×108个/mL灵菌悬浮液加入到1.5 mL离心管中,以12 000 r/min离心5.0 min,去掉上清,分别加入10种消毒剂的生产实用浓度的溶液1.0 mL,震荡摇匀,分别处理10 min、20 min、30 min;离心,利用无菌水清洗2次,再加入50 μL无菌水,取菌悬液加入到LB平板中,利用玻璃棒均匀涂抹,37 ℃培养24 h,观察是否有红色菌落生长。同时分别配制10种消毒剂的生产实用浓度的2倍、5倍、10倍浓度的溶液,用配制好的消毒液处理家蚕灵菌病原体10 min。每种处理设3个重复,同时设立无菌水处理菌体的阳性对照和无菌水空白阴性对照。(2)对家蚕白僵病病原体的杀灭试验。参考1.2.3(1)家蚕灵菌败血病病原体的杀灭试验处理方法进行,以PDA平板于28 ℃培养10 d的白僵菌配制成1.5×108个/mL的分生孢子悬浮液代替5.0×108个/mL的灵菌悬浮液,处理好的PDA平板以28 ℃培养72 h,观察是否有白色菌落生长,其余处理与1.2.3(1)相同。(3)对BmNPV的杀灭试验。采用悬浮液法[7]调查10种消毒剂不同时间、不同浓度杀灭BmNPV的情况。用移液枪取200 μL的BmNPV多角体悬浮液于1.5 mL灭菌离心管中,以4 000 r/min离心5.0 min,去掉上清,分别加入10种消毒剂的生产实用浓度的溶液1.0 mL,震荡摇匀,分别处理10 min、20 min、30 min;离心,利用无菌水清洗2次,再加入200 μL无菌水;将处理后的悬浮液200 μL均匀涂抹在2张4.0 cm2的桑叶上,给2龄起蚕(30头)添食;当家蚕食完含病原体的桑叶后,更换蚕座纸片,改用洁净桑叶饲养5 d,调查各区家蚕血液型脓病发病率。同时分别配制10种消毒剂的生产实用浓度的2倍、5倍、10倍浓度的溶液,处理BmNPV多角体10 min。每种处理设3个重复,同时设立无菌水处理BmNPV的阳性对照和无菌水空白阴性对照。(4)对Nb的杀灭试验。参考1.2.3(3)BmNPV的杀灭试验处理方法进行,以1.5×107个孢子/mL的孢子悬浮液代替1.5×107个多角体/mL的BmNPV多角体悬浮液,其余处理与1.2.3(3)相同。家蚕添食Nb后饲养12 d(至5龄第3 天),对各区家蚕逐头进行研磨镜检,调查并计算家蚕微粒子病发病率。

1.2.4 各种消毒剂生产实用浓度溶液的酸碱度测定 利用超纯水配制各种消毒剂的生产实用浓度溶液,再分别利用pH计测定各种消毒剂生产实用浓度溶液的pH值。

1.2.5 各种消毒剂的腐蚀性测定 准备好尺寸基本一致的铁片,用120号粒度的水砂纸将铁片磨光,去掉金属表面层,用水洗净凉干,于50 ℃烘干1 h,精确称其质量。将每种样片分别放入10种消毒剂的生产实用浓度溶液中浸泡3 d,每日更换1次新配的消毒液,同时设自来水为对照。浸泡结束后,将铁片洗净后干燥(于50 ℃烘干1 h),精确称其质量,根据公式R=8.76 ×107×(M-Mt )/(S×t×D)计算各种消毒剂的腐蚀速率(R)。其中R为腐蚀速率;M、Mt分别为试验前后金属片质量(g);S为金属片表面积(cm2);t为浸泡时间(h);D为金属密度(kg/m3)。本试验重复1次[8]。

2 结果与分析

2.1 10种消毒剂对家蚕病原体的杀灭效果

2.1.1 10种消毒剂的生产实用浓度溶液不同处理时间对灵菌、白僵菌、BmNPV和Nb的杀灭效果 从表2可以看出:戊二醛、聚维酮碘和癸甲丙二醇氯铵复合碘等3种消毒剂对家蚕病原体杀灭能力很差,即使处理30 min对家蚕灵菌、白僵菌仍然没有达到完全的杀灭效果;苯扎溴铵对家蚕灵菌有很好的杀灭效果,但对家蚕白僵菌、BmNPV、Nb的杀灭能力较差;癸甲溴铵、月苄三甲氯铵对家蚕灵菌、白僵菌有很好的杀灭效果,但对BmNPV、Nb的杀灭能力较差;二氧化氯和优氯净对家蚕灵菌、白僵菌和Nb具有很好的杀灭效果,但对BmNPV的杀灭能力较差,利用它们的生产实用浓度处理BmNPV达30 min也没有达到完全的杀灭效果。福尔马林对家蚕灵菌、白僵菌和BmNPV有很好的杀灭效果,但对Nb作用10 min仍未能达到完全的杀灭效果,20 min以上才达到完全的杀灭效果。漂白粉精对4种家蚕病原体杀灭效果最佳,利用它的生产实用浓度(有效氯含量为1.0%)处理病原体10 min,即可达到完全的杀灭效果。

表2 10种消毒剂生产实用浓度不同处理时间对灵菌、白僵菌、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕微孢子虫(Nb)的杀灭情况

在灵菌和白僵菌处理组中“-”表示无菌生长 ,“+”表示有少量菌生长,“++”表示有较多菌生长,“+++”表示有大量菌生长;在BmNPV和Nb处理组中各数据为各区蚕的发病率。阳性CK为不做任何处理的病原对照,阴性CK为无菌水对照。表3同。

表3 10种消毒剂生产实用浓度的不同倍数溶液对灵菌、白僵菌、BmNPV和Nb的杀灭情况

2.1.2 10种消毒剂不同浓度对家蚕灵菌、白僵菌、BmNPV和Nb的杀灭效果 采用悬浮液法测定10种消毒剂的不同浓度溶液杀灭4种家蚕病原体的效果。从表3可以看出:各种消毒剂的使用浓度对它们杀灭家蚕病原体能力具有一定影响,如提高戊二醛、聚维酮碘和癸甲丙二醇氯铵复合碘3种消毒剂的浓度为生产实用浓度的10倍后对家蚕灵菌、白僵菌和Nb就具有很好的杀灭效果,提高苯扎溴铵浓度也能够增强杀灭白僵菌的效果,证实戊二醛、聚维酮碘、癸甲丙二醇氯铵复合碘、苯扎溴铵等消毒剂的生产实用浓度偏低,需要提高浓度才能对家蚕病原体具有一定的杀灭效果;癸甲溴铵、月苄三甲氯铵、二氧化氯、优氯净保持对家蚕灵菌、白僵菌具有很好的杀灭效果,而且二氧化氯、优氯净对Nb还具有完全的杀灭效果,但这8种消毒剂基本对BmNPV没有杀灭效果,即使提高浓度的消毒效果也不佳。只有漂白粉精和福尔马林的各种浓度溶液对家蚕病原体均具有很好的杀灭效果。

2.2 10种消毒剂的生产实用浓度溶液的酸碱度

利用pH计测定10种消毒剂的生产实用浓度悬浮液的pH值(表4)。福尔马林、聚维酮碘、癸甲丙二醇氯铵复合碘、苯扎溴铵、癸甲溴铵、月苄三甲氯铵和二氧化氯消毒剂属于酸性,优氯净和戊二醛为弱碱性,漂白粉精为强碱性。

表4 10种消毒剂生产实用浓度溶液的酸碱度(pH值)

2.3 10种消毒剂的生产实用浓度溶液的腐蚀性

10种消毒剂的生产实用浓度溶液对铁片的腐蚀性测定结果见表5。从表5可以看出,戊二醛、福尔马林、聚维酮碘、癸甲丙二醇氯铵复合碘、苯扎溴铵、癸甲溴铵、月苄三甲氯铵等7种消毒剂对铁片有轻度腐蚀,二氧化氯对铁片有中度腐蚀,而优氯净和漂白粉对铁片的腐蚀程度达到重度腐蚀,优氯净腐蚀性最强。

表5 10种消毒剂生产实用浓度溶液对铁片的腐蚀情况

3 小结与讨论

消毒是控制养蚕生产传染性病害流行的重要手段,而家蚕病原微生物特征及养蚕方式决定了养蚕消毒不同于人用及其他兽用的消毒,应用的消毒剂有自身要求,消毒剂种类的选择直接影响蚕业生产的消毒效果和病害流行的控制[9]。目前,农村养蚕生产中使用的消毒剂种类繁多,本试验测定了10种消毒剂对家蚕病原体的杀灭效果,测定的戊二醛、聚维酮碘和癸甲丙二醇氯铵复合碘消毒剂的生产实用浓度溶液对家蚕各种病原体基本没有杀灭效果;苯扎溴铵、癸甲溴铵和月苄三甲氯铵消毒剂的生产实用浓度溶液只对家蚕病原细菌和真菌有一定的杀灭效果,但对BmNPV和Nb的杀灭能力均很差;二氧化氯和优氯净的生产实用浓度溶液对家蚕病原细菌、真菌和Nb有较好的杀灭效果,但对BmNPV的杀灭能力均很差;只有漂白粉和福尔马林的生产实用浓度溶液对各种家蚕病原体均具有较好的杀灭效果。试验证明各种消毒剂对家蚕病原体的消毒效果存在显著差异。

各种消毒剂的酸碱度对它们的杀菌活性有重要影响[10],酸性和弱碱性不利于裂解病毒多角体而无法杀灭病毒粒子,因此聚维酮碘、癸甲丙二醇氯铵复合碘、苯扎溴铵、癸甲溴铵、月苄三甲氯铵、二氧化氯消毒剂、优氯净和戊二醛对BmNPV的杀灭能力差,而漂白粉精对BmNPV的杀灭能力最好。优氯净是一种有机氯消毒剂,其有效成分是二氯异氰尿酸钠,呈酸性,对BmNPV多角体的杀灭效果很差,需要加入其他辅剂使混合物成为强碱性,才有利于完全杀灭家蚕病原体。

消毒剂有效成分的浓度对杀菌效果也有重要影响。如试验中采用戊二醛、聚维酮碘、癸甲丙二醇氯铵复合碘、苯扎溴铵等消毒剂的生产实用浓度,对4种家蚕病原体几乎都没有杀灭效果,而增加各消毒剂的浓度才具有一定的杀菌效果,如戊二醛消毒剂在有效成分浓度为0.02%(1∶100)和0.04%(1∶50)时无法有效杀灭灵菌、白僵菌,当增加浓度为0.20%(1∶10)时才能实现杀灭效果,证明了生产实用浓度偏低。戊二醛和福尔马林都是醛制剂,戊二醛消毒剂的生产实用浓度为0.02%,而福尔马林的生产实用浓度为2%,很显然福尔马林杀灭家蚕病原体的能力强,而戊二醛杀灭家蚕病原体的能力弱。王娜等[11]报道聚维酮碘在有效成分浓度为1.250 mg/L时对家蚕病原细菌和病原真菌才有完全的杀灭效果,但聚维酮碘的生产实用浓度仅为0.125 mg/L,远低于1.250 mg/L,很明显是没有杀灭效果的。因此,市场上销售的一些蚕用消毒剂使用时有效成分浓度偏低,应该是生产厂家从控制成本等方面考虑减少药物有效成分,这就造成这些消毒剂在养蚕生产中应用的消毒效果很差。另外,戊二醛、聚维酮碘、癸甲丙二醇氯铵复合碘、苯扎溴铵、癸甲溴铵和月苄三甲氯铵等药剂常用于人体、兽用卫生消毒,要求温和、环保,如聚维酮碘广泛应用于眼科术前结膜囊消毒,利用2.500 g/L的聚维酮碘消毒结膜囊才能有效降低结膜囊细菌量[12];而养蚕生产上应用聚维酮碘消毒的实用浓度是0.125 g/L,明显低于应用于人体消毒的浓度,消毒效果也就顺理成章地低了,这也是造成这些消毒剂对家蚕病原体消毒效果很差的原因。

随着养蚕生产形势的变化,蚕农非常关注消毒剂的腐蚀性问题,都尽量避免使用高腐蚀性消毒剂。本试验调查发现醛制剂、碘制剂和表面活性剂对铁片有轻度腐蚀,而氯制剂(漂白粉、优氯净)和其他类的二氧化氯对铁片的腐蚀性达到中度、重度腐蚀程度,这也是农村养蚕逐步减少使用氯制剂而选择醛制剂、碘制剂和表面活性剂进行蚕业消毒的主要原因之一。蚕业生产上,蚕病防控的主要措施仍然还是蚕室蚕具消毒、蚕体蚕座消毒,为达到有效控制蚕病的发生,也为了满足农村养蚕既能消毒防病又能降低成本的需求,仍需要进一步研发广谱、高效、低毒、低刺激、低腐蚀的新型蚕用消毒剂。