蝴蝶兰无菌播种组培快繁技术研究

郑秋桦，黎栋然，潘烨鑫，漆 萍，巫跃君

（1.韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005；2.广东艺景生态环境建设有限公司，广东 韶关 512031）

蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属，为附生性兰花，素有“洋兰王后”之称。新春时节，蝴蝶兰植株从叶腋中抽出花梗，开出形如蝴蝶的花朵，独特而优美的姿态深受消费者青睐。蝴蝶兰原产于亚热带雨林地区，分布在印度尼西亚、菲律宾、泰国、马来西亚及中国台湾等地。通过人工调控各种因素使蝴蝶兰于春节前开放，极大地满足了国内年宵花的市场需求。随着近年来种植面积和产销量增加，我国蝴蝶兰产业得到跨越式发展，已逐渐成为全球蝴蝶兰种苗供应中心［1］。蝴蝶兰的种子非常细小，不含有为种子萌发提供营养的胚乳或其他组织，胚发育不完全，在自然条件下很难萌发［2］，因此兰科种子的无菌培养是工厂化生产兰花种苗的一条重要途径。

文章在原有培养基的基础上，通过调整6-BA浓度，设置6-BA 浓度梯度，分别培养新杂交品种蝴蝶兰种子（纳博纳交樱桃番茄、纳博纳交矩宝橘子），研究不同6-BA 浓度下培养基对于诱导蝴蝶兰种子原球茎形成的作用效果。通过设置不同6-BA浓度、NAA 浓度及不同添加物组合，探究其对诱导原球茎芽分化的影响，优化培养基，提高培养基的应用价值。

1 试验材料和方法

1.1 材料和试剂

材料：纳博纳交矩宝橘子果荚（取自蝴蝶兰基地）、纳博纳交樱桃番茄果荚（取自蝴蝶兰基地）、椰子水、土豆、香蕉、蔗糖。

主要试剂：MS 培养基、1 mg/L 6-BA、1 mg/L KT、1 mg/L NAA、琼脂粉、1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、蒸馏水、75%的酒精、0.1% HgCl2、无菌水、消毒液（工作台）。

1.2 仪器和设备

电子秤、称量纸、玻璃棒、大烧杯、小烧杯、2 mL移液管、洗耳球、电磁炉、铁锅、胶头滴管、容量瓶、铅笔、标签纸、量筒、培养瓶、高压蒸汽灭菌锅、pH 试纸、纸巾、超净工作台、高温消毒器、接种器械（解剖刀、剪刀、镊子等）、无菌不锈钢碟子、酒精灯、记号笔等。

1.3 试验方法

1.3.1 预试验

配制1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH。称取MS 培养基粉溶解于蒸馏水后倒入大烧杯，分别量取适量的6-BA、KT、NAA 加入其中。在锅中加入蒸馏水，蒸馏水润洗烧杯3 次，中火煮至溶解，慢慢加入琼脂粉，小火煮开后将蔗糖-琼脂粉溶液倒入烧杯与其他混合溶液搅拌均匀，调节pH 值。将混合溶液转移至1 L 容量瓶定容，用量筒量取培养基分装到培养瓶中，在标签纸上写明配制日期、配制人、培养基类型并贴在培养瓶上。准备好瓶装蒸馏水、75%酒精、HgCl2和空培养瓶，除了酒精以外，所有培养瓶经过高压蒸汽灭菌后冷却待用。

1.3.2 无菌播种

开裂的果荚内部往往存在微生物，因此需检查果荚完整度。若果荚完好无损，则可以作为试验材料；若果荚已经开裂或存在破损，则需要更换材料。用自来水冲洗果荚，摘除花瓣和花萼后用洗洁精洗涤，去除表面污渍和灰尘，接着用75%酒精擦拭，放在解剖盘中转移到超净工作台上，用解剖刀切除两端多余部分后（方便操作，但不能露出内部的种子）用镊子转到无菌瓶中。将75%酒精倒入放置果荚的无菌瓶中浸泡30 s，将果荚转移到装无菌水的瓶子中冲洗2 次［3］。用0.1%升汞浸泡果荚10～12 min，中途需摇晃瓶身，保证果荚被充分浸泡，用无菌水冲洗8 次后取出蒴果，置于托盘中［4］。取无菌纸将果荚表面的水分吸干，防止种子被粘住而影响播种。用解剖刀纵切，采用撒播法，用镊子挑出大小一致的棉絮状物体，将种子均匀撒播在培养基上，盖好瓶盖并贴上标签。每个浓度的培养瓶重复3 次，将培养基置于温度26 ℃、光照强度1 500 lx、光照时长12 h/d 的环境中培养。

1.3.3 原球茎芽分化诱导

在一定阈值内，低浓度6-BA 和高浓度的NAA有利于诱导原球茎产生丛生芽［5］，因此就6-BA 和NAA 浓度设置了12 个对照组，如表1所示。

表1 原球茎芽诱导剂中不同6-BA和NAA浓度正交试验对照组

不同添加物对于原球茎的丛生芽诱导影响可能存在差异，设置4 个对照组可以降低成本，提高芽诱导效率，如表2所示。

表2 原球茎芽诱导剂中不同添加物对照组

在试验前分别配制各组培养基，高压灭菌后放置冷却备用。在无菌操作下用镊子将母瓶中的原球茎转移到无菌解剖盘中，由于每个无菌播种培养瓶中原球茎数量较多，完成一次母瓶的接种时间较长，且超净工作室风速较大，一次取出过多原球茎会导致部分原球茎失水粘住解剖盘，失去利用价值，因此接种时每次应取出适量原球茎，一个母瓶中的原球茎分多次取出接种。分别将原球茎接种到各培养瓶中，每组接5 瓶，每瓶30 个原球茎，重复12 次。接种时应将原球茎的突起一端朝下，凹陷或非突起的一端朝上，否则会导致原球茎长势不佳，容易产生较多醌类物质，导致原球茎坏死。将完成接种的培养瓶放置在温度为26 ℃、光照强度1 500 lx、光照时长12 h/d 的环境中培养，观察原球茎的生长状态以及是否发生污染。

2 结果与分析

2.1 无菌播种原球茎诱导试验结果与分析

在一定范围内，随着培养基中6-BA 浓度的提高，纳博纳交矩宝橘子蝴蝶兰杂交种子萌发率也会有所提高。其中种子萌发的最适6-BA 浓度为≥4.5 mg/L。不同6-BA 浓度的培养基中原球茎中产生的醌类物质明显不同，除了4.0、4.5 mg/L 浓度6-BA 培养基外，其他浓度6-BA 培养基中原球茎都产生了较多醌类物质。其中，添加1.5、2.0 mg/L 浓度的6-BA 培养基中的原球茎产生的醌类物质最多，这些培养基中产生的醌类物质能够随着时间的推移扩散，短期内不会对原球茎产生毒害。

该试验中，播种后4 d 内种子膨大，50 d 后纳博纳交樱桃番茄蝴蝶兰杂交种子的萌发率依旧为0，经过一段时间暗处理后出现零星的原球茎。推测可能是由于种子发育不良导致原球茎产生速度缓慢，或是该杂交品种蝴蝶兰种子的萌发需要进行暗处理。

2.2 原球茎芽分化诱导剂正交试验结果与分析

在一定浓度范围内，浓度较低的NAA 有利于纳博纳交矩宝橘子蝴蝶兰杂交新品种原球茎的芽分化，其中最适NAA 浓度值为3.0 mg/L。本试验中设置不同6-BA 浓度的培养基中原球茎芽分化的情况大致表现为6-BA 浓度越高原球茎芽分化率越高，即促进原球茎芽分化的最适6-BA 浓度≥0.5 mg/L。

在不同6-BA 和NAA 浓度组合的培养基中，原球茎中产生的醌类物质的量存在差别。根据培养基的颜色来看，本试验设置的组合中较低浓度的NAA 和6-BA 组合容易使原球茎产生有毒的醌类物质。不同浓度6-BA 中原球茎产生的醌类物质并无太大区别，结合第1 阶段培养现象，推断第2 阶段中出现的现象是由于该培养阶段培养基中6-BA 浓度梯度设置较小。不同浓度NAA 中原球茎产生的醌类物质的区分较为明显，低浓度的NAA 易使原球茎产生更多的醌类物质，这些醌类物质难以在培养基中扩散开，对原球茎具有毒害作用，少数原球茎经过30 d 培养后褐化死亡。由此得出，在诱导该新杂交品种蝴蝶兰原球茎芽分化时需关注醌类物质的产生情况，及时转移原球茎。

2.3 原球茎芽诱导剂中加入不同添加物试验结果与分析

根据表2 的试验条件依次进行正交试验，记录数据并进行分析，试验结果如表3所示。

表3 原球茎芽诱导剂中加入不同添加物试验结果

由表3 可以得出，与空白对照组相比，添加了土豆、香蕉汁或椰子水的培养基会对原球茎芽形成产生促进作用。其中，椰子水与土豆、香蕉汁相比促进效果更为明显。在这组试验中，香蕉汁、土豆和空白对照组中培养基未见显色物质，推测未产生或仅产生少量醌类物质。

3 结论

本试验通过配置含不同激素水平及添加物的培养基对纳博纳交樱桃番茄和纳博纳交矩宝橘子2 种新杂交品种蝴蝶兰种子和原球茎进行阶段性培养，探究不同6-BA 浓度对于诱导新杂交品种蝴蝶兰种子形成原球茎的影响，6-BA、NAA 浓度以及香蕉汁、椰子水与土豆对于原球茎芽分化的影响。

在植物生长调节剂添加方面，纳博纳交樱桃番茄蝴蝶兰杂交种子最终长出了零星的原球茎，推测可能是由于种子发育不良导致原球茎产生速度缓慢，或是该杂交品种蝴蝶兰种子的萌发需要进行暗处理。第1 阶段实验结果显示最适NAA 浓度值约为3.0 mg/L，符合前人的研究。第2 阶段试验结果可以得出，纳博纳交矩宝橘子原球茎芽诱导最适NAA 浓度为3.0 mg/L，最适6-BA 浓度为0.25 mg/L，当6-BA 浓度高于或低于该值时，原球茎的芽分化率会下降。在添加物方面，添加了土豆、香蕉汁或椰子水的培养基对原球茎芽诱导产生促进作用。在添加物方面，椰子水与土豆、香蕉汁相比促进效果更为明显。

此外，本试验中还发现了一些现象。在种子萌发形成原球茎阶段，低浓度6-BA 的环境会使原球茎产生较多的醌类物质，但短期内不会对其成活造成影响，后期保留观察的无菌播种培养瓶中原球茎长势良好，大部分分化出芽，但与芽诱导培养基中原球茎分化出的芽相比，无菌播种培养基中的芽个体明显较小。同时，培养基褐色变淡，推测可能是这一阶段醌类物质含量会随着培养时间的推移减少。在诱导原球茎芽分化阶段，由于芽分化比较缓慢，在接种后30 d 进行数据统计，统计出的数据规律性不强，难以体现出不同组合培养基对于蝴蝶兰原球茎芽诱导影响的差别；在接种后45 d 进行数据统计，得到同一组内数据的可信度较高，不同组数据呈现出一定的规律，由此推断蝴蝶兰原球茎芽诱导剂最佳数据收集时间应≥45 d。由于6-BA 浓度梯度设置较窄，整体看来在这一阶段低浓度的6-BA不会使原球茎产生大量醌类物质；低浓度的NAA 会使原球茎产生醌类物质的量明显增加，能够在短期内对原球茎产生毒害作用，若要保证芽分化的效率需关注醌类物质的产生情况并及时转移原球茎。在不同添加物对照试验中，香蕉汁、土豆和空白对照组中没有或仅有极少量醌类物质产生。