伊布替尼血药浓度检测方法的建立及临床应用Δ

韩功伟 ，张 腾 ，赵营莉 ，刘沁华 ，夏 泉 ，2#（.安徽医科大学药学院，合肥 2002；2.安徽医科大学第一附属医院药剂科，合肥 20022；.合肥市第二人民医院药学部，合肥 2002；.安徽医科大学第一附属医院血液科，合肥 20022）

伊布替尼是首个不可逆的布鲁顿氏受体酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）抑制剂，可通过抑制B细胞受体信号来减少B 细胞的增殖、迁移和凋亡，从而发挥阻断B细胞白血病和淋巴瘤所需生长信号的作用。临床研究证实，该药可明显延长慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者的生存时间[1―2]。2017年，伊布替尼获我国国家食品药品监督管理总局批准用于治疗CLL/小淋巴细胞性淋巴瘤（small lymphocytic lymphoma，SLL）、套细胞淋巴瘤（mantle-cell lymphoma，MCL）和华氏巨球蛋白血症（Waldenström’s macroglobulinemia，WM）等非霍奇金淋巴瘤[3]。随着伊布替尼在临床的广泛应用，该药引起的出血、房颤、腹泻、上呼吸道感染、疲劳等常见的轻微（Ⅰ～Ⅱ级）不良反应逐渐被发现，且房颤、出血还可能会导致Ⅲ级及以上严重不良反应的发生，其安全性越来越受到临床关注。

伊布替尼主要由细胞色素P450 代谢，在相同的服药剂量下，不同人群可能存在较大的浓度差异，且这种差异无法避免[4―5]。有研究认为，较高的伊布替尼药-时曲线下面积（area under curve，AUC）与药物不良反应的发生有关[6]。因此，该药的峰浓度可用于预测患者是否存在较高的药物毒性风险。虽然有研究报道了使用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术检测伊布替尼的血药浓度[7]，但该方法的设备价格高，操作复杂，很难在医疗机构普及。为此，本研究建立了检测人血浆中伊布替尼浓度的高效液相色谱（HPLC）法，并应用于临床，旨在为伊布替尼的个体化给药及药物毒性风险预测提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括1260 Infinity Ⅱ型HPLC仪[安捷伦科技（中国）有限公司]，KDC-1044型低速离心机、HC-3018 型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），XW-80A型涡旋机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），MG-2200 型氮气吹干仪（东京EYELA公司）。

1.2 主要药品与试剂

伊布替尼对照品（批号S81126，纯度99%）购自上海源叶生物科技有限公司；泽布替尼对照品（内标，批号420076-202001，纯度99.5%）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱级，甲酸、磷酸二氢钾均为分析纯，水为注射用无菌用水。

1.3 血浆样本

空白血浆由未使用过伊布替尼或泽布替尼的健康志愿者提供。提供者均签署了知情同意书。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液（43∶57，V/V）为流动相；流速为1 mL/min；检测波长为260 nm；柱温为40 ℃；进样量为20 μL；运行时间为25 min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液与内标储备液

精密称取伊布替尼、内标对照品各10.00 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制得质量浓度均为1 mg/mL的对照品储备液和内标储备液。

2.2.2 系列标准曲线溶液、质控溶液与内标工作液

取“2.2.1”项下对照品储备液40 μL，加入甲醇960 μL，制得质量浓度为40 μg/mL的伊布替尼工作溶液，再用甲醇稀释，得质量浓度分别为0.8、2.0、4.0、8.0、16、32、40 μg/mL 的系列标准曲线溶液（分别以0.8、2.0、16、32 μg/mL作为定量下限、低、中、高质量浓度的质控溶液）。取“2.2.1”项下内标储备液20 μL，加入甲醇980 μL，得质量浓度为20 μg/mL内标溶液；取该溶液400 μL，加入甲醇600 μL，得质量浓度为8 μg/mL的内标工作液。

2.3 样本前处理

取血浆样本780 μL，分别加入“2.2.2”项下质控溶液10 μL 和内标工作液10 μL，再加入水700 μL，混匀，得载样前样本；取该样本，经固相萃取柱（先加入甲醇1 mL，再加入水1 mL活化），依次用水1 mL、甲醇-水溶液（60∶40，V/V）1 mL淋洗，再用甲醇-甲酸溶液（98∶2，V/V）0.5 mL 洗脱2 次后，收集洗脱液，在40 ℃下以氮气流吹干，残渣用甲醇-甲酸溶液（98∶2，V/V）100 μL 复溶，以12 000 r/min离心10 min，取上清液进样检测。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验

取5 份不同来源的空白血浆，不加入质控溶液和内标工作液，其余按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图（图1A）。取空白血浆，加入“2.2.2”项下定量下限质量浓度质控溶液（0.8 μg/mL）及内标工作液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图（图1B）。取某患者用药（每日服用伊布替尼胶囊1次，每次420 mg，服药30 d）2 h 后血浆样本，加入内标工作液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图（图1C）。结果显示，伊布替尼与内标的保留时间分别约为22.7、11.6 min，空白血浆对目标成分和内标检测无干扰，表明本方法的专属性良好。

图1 伊布替尼定量分析的HPLC图

2.4.2 线性关系与定量下限考察

取“2.2.2”项下系列标准曲线溶液和内标工作液，按“2.3”项下方法处理，得质量浓度分别为10、25、50、100、200、400、500 ng/mL 的标准曲线溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样检测。以伊布替尼质量浓度为横坐标（x）、伊布替尼峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（y），采用加权最小二乘法进行线性回归，得伊布替尼的回归方程为y＝1.041 4x+0.137 9（R2＝0.998 9），表明伊布替尼检测质量浓度在10～500 ng/mL范围内与峰面积比值的线性关系良好。其定量下限为10 ng/mL。

2.4.3 准确度与精密度试验

取“2.2.2”项下质控溶液和内标工作液，按“2.3”项下方法处理，得质量浓度分别为10、25、200、400 ng/mL 的溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样检测，每样本平行测定10份，考察批内精密度；每样本平行测定5份，连续测定3 d，考察批间精密度。将实测质量浓度与理论质量浓度进行比较，以相对误差（relative error，RE）考察准确度。结果显示，批内、批间精密度试验的RSD 均不高于12.77%，RE 为－2.14%～6.51%，表明本方法的准确度、精密度良好。结果见表1。

表1 准确度与精密度试验结果

2.4.4 提取回收率试验

取“2.2.2”项下低、高质量浓度的质控溶液（质量浓度分别为2.0、32 μg/mL）和内标工作溶液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录伊布替尼峰面积与内标峰面积的比值（A1）。取空白血浆，按“2.3”项下方法处理后，加入相应质量浓度的质控溶液和内标工作液（使最终质量浓度与前者一致），再按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录伊布替尼峰面积与内标峰面积的比值（A2）。每样本平行测定5 次，按下式计算提取回收率：提取回收率＝A1/A2×100%。结果显示，提取回收率分别为74.80%、97.70%，RSD 均小于2.90%（n＝5）。

2.4.5 稳定性试验

取“2.2.2”项下低、高质量浓度的质控溶液（质量浓度分别为2.0、32 μg/mL）和内标工作溶液，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下色谱条件进样检测，分别考察处理前样本在4 ℃下放置12 h，－20 ℃下分别保存30、60 d，处理后样本在自动进样器中放置12 h时的稳定性，每样本平行测定5份。结果显示，低质量浓度溶液稳定性试验的RSD 分别为2.81%、2.63%、2.48%、7.06%（n＝5），高质量浓度溶液稳定性试验的RSD 分别为0.79%、5.06%、1.70%、3.87%（n＝5），表明不同条件下各样本稳定性良好。

2.5 临床应用

2.5.1 纳入与排除标准

本研究的纳入标准为：（1）年龄18～80 岁；（2）经病理学检查明确诊断为CLL/SLL或MCL或WM；（3）具有完整的疗效评价资料和不良反应信息；（4）签署了知情同意书。

本研究的排除标准为：（1）中重度肝肾功能不全者；（2）妊娠期或哺乳期妇女；（3）依从性差者。

2.5.2 资料来源

选择2022年8月1日至2023年5月1日在安徽医科大学第一附属医院接受伊布替尼治疗的9例非霍奇金淋巴瘤患者（7例CLL，1例MCL，1例WM）。本研究方案经医院医学伦理委员会批准，伦理批件号：PJ2022-11-17。

2.5.3 用药方法

所有患者均连用伊布替尼胶囊（国药准字HJ20181066，美国Catalent CTS LLC，规格 140 mg）超过30 d，用药频率为每天1次，用药剂量根据病情分为每天280 mg 或420 mg，其中1 例患者为280 mg，8 例患者为420 mg。

2.5.4 检测方法与检测结果

从患者签署知情同意书日起连续用药至少30 d，采集患者第30 天用药后2 h 的静脉血[8]，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积并代入随行标准曲线计算伊布替尼的血药浓度。结果显示，1 例服用280 mg/d 患者的血药浓度为176.583 ng/mL，8 例服用420 mg/d 患者的血药浓度分别为15.341、15.746、21.275、26.764、37.325、117.170、169.451、279.628 ng/mL。结果见图2。

图2 9 例患者第30 天用药后2 h 的伊布替尼血药浓度分布

3 讨论

Ezzeldin 等[9]使用LC-MS/MS 技术检测了人血浆中伊布替尼的浓度，使用液-液萃取法进行样本前处理，线性范围为5～1 000 ng/mL。本研究在文献报道的基础上进行了调整，以不同比例的甲醇-水溶液作为固相萃取的淋洗液和洗脱液，能有效去除杂质，提高伊布替尼回收率，且试剂简单易得，方法简便快捷，故选择甲醇-水溶液作为样本前处理试剂。在选择流动相时，本研究使用乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液为流动相，当二者比例为40∶60～50∶50（V/V）时，所得色谱峰峰形良好；随后将乙腈以1%的比例梯度增加，当二者比例为43∶57（V/V）时，所得色谱峰峰形最优，故选择乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液（43∶57，V/V）为流动相。

有文献指出，非复发型CLL 患者服用伊布替尼420 mg/d 后，第1 天血药浓度为140.93 ng/mL，第8 天为82.80 ng/mL，且患者可耐受该药的不良反应[10]。本研究中，有1例患者因服用伊布替尼420 mg/d后出现心悸、房颤等不良反应，医师在评估临床疗效及不良反应后给予减量（280 mg/d）处理；经剂量调整后，患者服用280 mg/d的伊布替尼仍有效，其血药浓度为176.583 ng/mL；8例服用伊布替尼420 mg/d的患者中，血药浓度最低为15.341 ng/mL，而本方法的定量下限为10 ng/mL，表明本方法可以满足临床治疗药物监测的需求。本研究所得线性范围为10～500 ng/mL，患者可在25 min 内完成血浆浓度的检测，对设备要求不高，适宜常规医疗机构开展血药浓度检测。此外，因泽布替尼与伊布替尼有相近的理化性质且与伊布替尼同属BTK抑制剂，故选择泽布替尼为内标；同时，本研究建立的方法也可用于后续拓展检测泽布替尼的血药浓度。

非霍奇金淋巴瘤是一种惰性肿瘤，绝大部分的CLL、WM初诊患者和部分MCL患者无明显症状。有研究发现，虽然伊布替尼可延长患者的生存时间[11]，但也会因药物的相互作用[如同时使用肝药酶抑制剂（酮康唑）]或者禁食而导致伊布替尼血药浓度发生变化，甚至可能加重伊布替尼引起的出血、房颤等不良反应[12]。伊布替尼主要通过细胞色素P450 代谢，由于患者代谢酶差异而可能导致个体间药物浓度不同[13]。本研究中，8例服用相同剂量伊布替尼患者的血药浓度为15.341～279.628 ng/mL，这提示该药的个体差异较大。有文献指出，伊布替尼的血药峰浓度大于70 ng/mL，对CLL 或MCL有治疗作用[14]。因此，通过检测伊布替尼的血药浓度及临床生化指标，可对其用药剂量进行及时调整，从而实现个体化给药。

综上所述，本研究所建立的HPLC 法简单、快捷，可用于伊布替尼血药浓度的测定。