史宾格犬ASIC1 基因SNPs 对mRNA 二级结构的影响

朱程程 程占军 万 宁 佘 奕 李来有

胞外pH 值的下降能激活一种在体内广泛分布的特殊配体门控通道，即酸敏感离子通道（scid-sensing ion channels, ASICs)。ASICs 也称作H+门控离子通道，是上皮钠离子通道/退化蛋白（ENaC/DEG）超家族一个分支。ASICs 由5 个功能基因编码，分别为ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4和ASIC5。迄今为止，已克隆出ASICs 的7 个亚单位：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4、ASIC5，不同亚基存在分布特异性，7个亚基可以组成同聚体或异聚体酸敏感离子通道。

ASIC1a 是哺乳动物体内含量最为丰富的ASICs 亚基，由ASIC1 基因编码，广泛分布于中枢神经系统和外周感觉神经元。有研究报道，ASIC1a 参与突触可塑性、学习记忆及条件性和天生恐惧情绪等生理过程。课题组前期研究结果表明，史宾格犬ASIC1 基因存在三个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP），分别在外显子2 的9 bp 处存在一个G →C 的单碱基突变（9 G＞C）、在外显子4 的102 bp 处存在一个A →C 的单碱基突变（102 A＞C）和外显子5 的20 bp 处存在一个G →A 的单碱基突变（20 G＞A），突变位点102 A＞C 和20 G＞A 属于同义突变，其中突变位点102 A＞C 与史宾格犬恐惧行为密切相关。

虽然同义SNP 不会改变编码的氨基酸，但有研究表明，同义SNP 可通过改变mRNA 二级结构进而影响基因功能的发挥，因此，本研究的主要目的在于分析史宾格犬ASIC1 基因的SNPs 是否会对mRNA 的二级结构产生影响，为今后探索ASIC1 基因影响犬恐惧行为的分子机制奠定基础。

一、材料与方法

（一）序列获取

犬ASIC1 基因参考序列（NC_006609.3）和mRNA 参 考 序 列（XM_022411217.1）信息资料来源于美国国家生物技术中心（National Center Biotechnology Information, NCBI）的GenBank 数据库。

（二）mRNA 二级结构预测

使用RNA fold web server 在线生物信息学分析软件对史宾格犬ASIC1 基因外显子2 上的9 G＞C 位点、外显子4 上的102 A＞C 位点和外显子5 上的20 G＞A 位点突变前后基因转录mRNA 二级结构进行预测并对比分析。

二、 结果与分析

利用RNA fold web server 在线软件对ASIC1基因外显子2 上的9 G＞C 位点、外显子4 上的102 A＞C 位点和外显子5 上的20 G＞A 位点突变前后转录的mRNA 二级结构进行预测，结果见下图。对比突变前后的ASIC1 基因mRNA 二级结构图发现，外显子区3 处突变位点均导致mRNA 二级结构发生改变。外显子2 上的9 G＞C 位点使最小自由能由-1442.34kcal/mol 变为-1440.44 kcal/mol，突变后最小自由能升高，稳定性降低。外显子4 上的102 A＞C 位点和外显子5 上的20 G＞A 位点，使最小自由能由-1442.34kcal/mol 分别 变 为-1444.14kcal/mol 和-1442.84kcal/mol，突变后最小自由能降低，稳定性升高。

图1 参考序列

图2 外显子2 上9 G＞C 突变后

图4 外显子5 上的20 G＞A 位点突变后

三、讨论

ASIC1a 不仅参与外周疼痛的感受和传导、中枢的学习和记忆等高级功能及情感性精神活动的调节，而且还对异常的恐惧和焦虑症的发生发展有一定作用。有研究表明，敲除ASIC1a 蛋白，小鼠与杏仁核相关的暗示功能和恐惧条件反射都明显受损，而过表达ASIC1a，小鼠获得性恐惧相关行为会明显增加。除小鼠外，人ASIC1 基因rs685012 位点也与惊恐障碍等疾病显著相关。课题组前期的研究结果表明，史宾格犬ASIC1 基因也存在与恐惧行为相关的SNP位点。

mRNA 是单链分子，倾向于通过自身碱基互补配对形成大量稳定的二级结构。mRNA 二级结构是mRNA 上最重要的翻译调控因素之一，参与了mRNA 的细胞质定位、翻译起始、蛋白质共翻译折叠等过程的调控。mRNA 二级结构可以通过结构稳定性的变化来调控翻译过程，且mRNA 二级结构稳定性与蛋白质表达量之间存在显著正相关。

关于SNP 位点会对基因转录的mRNA二级结构产生影响已经在猪、牦牛、荷斯坦牛等多种动物上被证实。从江香猪DRD1 基因的SNPs 位点、大通牦牛TLR2基因SNPs 位点、荷斯坦牛BoLA-DRA 基因和DQA2 基因SNPs 位点都会影响基因转录的mRNA 二级结构，改变最小自由能，改变稳定性。

本研究使用RNA fold web server 在线生物信息学分析软件对史宾格犬ASIC1基因外显子2 上的9 G＞C 位点、外显子4 上的102 A＞C 位点和外显子5 上的20 G＞A 位点突变前后mRNA 二级结构进行预测并对比分析。本研究结果表明，外显子2 上的9 G＞C 位点使ASIC1 基因转 录mRNA 二级结构稳定性降低，外显子4 上的102 A＞C 位点和外显子5 上的20 G＞A位点均提高了mRNA 二级结构的稳定性。由于SNP 可通过改变mRNA 二级结构稳定性进而影响基因功能的发挥，因此，本研究结果可为今后探索ASIC1 基因影响犬恐惧行为的分子机制奠定理论基础。