丹参酮ⅡA 通过调控HMGB1 表达抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻大鼠脓毒症肺损伤机制研究

黄约诺 叶 威 郑青秀 潘锟镭 李献超 王世强

脓毒症是全身严重感染及多器官功能衰竭的炎症反应，死亡率高达50%～70%[1]。目前脓毒症发生急性肺损伤的主要机制是炎症反应。脓毒症肺损伤时，高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是人体发生炎症反应的启动者，是脓毒症发生发展中发挥致死效应的关键促炎因子。HMBG1 通过模式识别Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4），TLR4 与HMGB1 结合后可通过髓样分化因子88（myeloiddifferentiation-factor88，MyD88）活化核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），在脓毒症过程中进一步释放出大量炎症因子，导致病情进展。丹参酮ⅡA 是中药丹参的脂溶性成分，在众多靶器官中，肺脏中分布的丹参酮ⅡA 浓度最高，且具有抗炎作用[2-4]。本研究基于动物模型——脓毒症肺损伤大鼠，探讨丹参酮ⅡA 通过TLR4/MyD88/NF-κB 通路参与脓毒症的发病和进展，为临床诊疗提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 动 物 25 只SPF 级健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠购于上海斯莱克公司，体质量220～250 g，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。大鼠饲养于浙江中医药大学动物实验中心，实验饲养室许可证号：SYXK（浙）2021-0012，饲养环境：温度（20±2）℃，湿度55%，12 h 光暗环境交替，大鼠可自由饮水、进食，实验开始前适应性饲养1 周。本实验经浙江中医药大学动物管理与伦理委员会审核通过（伦理批号：IACUC-20211213-11）。

1.2 主要药物及试剂 丹参酮ⅡA 磺酸钠注射液（批号C13034027），购自上海麦克林生化科技股份有限公司；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（批号G1120），购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol（批号15596-018），购自Invitrogen 公司；RT SuperMix for qPCR（批号K1074）、2X SYBR Green qPCR Master Mix（批号K1070），均购自美国APExBIO 生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 石蜡包埋机（Thermo Fisher 公司，Shandon Histocentre 2），烘箱（上海精宏实验设备有限公司，DHG-9070A），旋转石蜡切片机（Thermo Fisher 公司，Finesse 325），微量移液器（德国Eppendorf 公司，3123000250，3123000268，3123000225），显微镜（OLYMPUS，CKX41），实时荧光定量PCR 仪（LightCycler 96，Roche），电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表有限公司，HW-SY11-KP2），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，CPA）等。

1.4 实验分组及模型制备 随机取20 只SPF 级SD大鼠采用盲肠结扎穿孔法（cecal ligation and perforation，CLP）造模[5]，随机编号后分为四组，即模型组及低、中、高剂量治疗组，每组5 只。CLP 术后2 h，模型组腹腔注射0.9%氯化钠注射液（20 mL/kg），低、中、高剂量治疗组腹腔注射不同剂量丹参酮ⅡA（5、10、20 mg/kg）。另取5 只SPF 级SD 大鼠作为假手术组，2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉成功后，开腹翻动肠道后关闭腹腔，2 h 后，观察大鼠一般情况，腹腔注射0.9%氯化钠注射液（20 mL/kg）。各组大鼠干预完成后等待24 h，再次麻醉大鼠，采用腹主动脉抽血至大鼠缺血死亡。五组大鼠处置后，用剪刀剪下心肺，快速完整剥离肺脏，用生理盐水冲洗干净后，分离左右两肺。

1.5 肺组织石蜡切片的制作及HE 染色 取大鼠左肺上叶，固定在10%甲醛中24 h，所有组织标本经梯度乙醇及二甲苯脱水，石蜡包埋、切片、捞片、烤片。苏木素染液浸3～5 min；流水返蓝2 h；流水冲洗玻片，浸伊红染液5 min；95%无水乙醇、二甲苯各两缸分别5 min，中性树胶封片分别在光镜下以200 倍数观察大鼠肺组织病理变化。

1.6 肺组织湿/干重比（W/D）测定 取大鼠新鲜右肺上叶组织，滤纸擦干，电子天平称重，即为湿重（W），再放入85 ℃烤箱中连续干燥24 h，直至重量恒定不变，电子天平称重，即为干重（D），计算W/D 比值。

1.7 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 的表达 取大鼠右肺中下叶，Trizol 法提取组织RNA。1 mL Trizol裂解组织，200 μL 氯仿抽提，4 ℃，12000 r/min 离心15 min，取上层水相，加入400 μL 异丙醇后，静置10 min，4 ℃，12000 r/min 离心10 min，取沉淀，无水乙醇洗3 次，静置干燥，核酸蛋白检测仪检测产物浓度。将提取的总RNA 通过PCR 逆转为cDNA。利用实时荧光定量PCR 检测目标基因表达水平，用2-△△CT表示mRNA 表达水平。引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.8 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件进行数据统计，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s） 表示，方差齐的数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差不齐时选Dunnett's T3法，两两比较采用多样本方差检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织形态学变化 假手术组大鼠的肺组织颜色无异常，结构完整，肺泡壁完整，没有塌陷，间隔无增宽，无水肿，肺泡腔清晰、干净，毛细血管无充血等；模型组大鼠肺组织呈暗红色，肿胀，结构破坏，部分肺泡塌陷、渗出、水肿、间隔增宽，毛细血管充血，淤血，有进展，且无减轻趋势；低、中剂量治疗组大鼠肺组织较模型组大鼠肺组织损伤明显减轻，但较假手术组严重，高剂量治疗组肺组织受损最轻。见图1。

图1 光镜下大鼠肺组织形态学变化（HE 染色，200×）

2.2 各组大鼠肺组织W/D 比较 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织W/D 明显增大，差异有统计学意义（P＜0.01）；而低、中、高剂量治疗组大鼠肺组织W/D较假手术组增大不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，低剂量治疗组大鼠肺组织W/D 减小不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量治疗组大鼠肺组织W/D 明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2。

表2 各组肺组织W/D 比较（±s）

表2 各组肺组织W/D 比较（±s）

注：假手术组开腹，仅翻动肠道后关腹，腹腔注射生理盐水；模型组造模，腹腔注射生理盐水；低剂量治疗组造模，腹腔注射丹参酮ⅡA（5 mg/kg）；中剂量治疗组造模，腹腔注射丹参酮ⅡA（10 mg/kg）；高剂量治疗组造模，腹腔注射丹参酮ⅡA（20 mg/kg）；W/D 为肺组织湿/干重比；与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别假手术组模型组低剂量治疗组中剂量治疗组高剂量治疗组F 值P 值鼠数55555 W/D 4.50±0.12 5.09±0.42a 4.62±0.37 4.46±0.29b 4.27±0.21c 5.164 0.005

2.3 各组大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 表达量比较 与假手术组比较，模型组肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 表达上调，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中、高剂量治疗组肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 的表达下调，差异有统计学意义（P＜0.01），低剂量治疗组肺组织TLR4、MyD88、HMGB1 mRNA 表达下调（P＜0.05 或P＜0.01），而NF-κB 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA表达量比较（2-△△CT，±s）

表3 各组肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA表达量比较（2-△△CT，±s）

注：假手术组开腹，仅翻动肠道后关腹，腹腔注射生理盐水；模型组造模，腹腔注射生理盐水；低剂量治疗组造模，腹腔注射丹参酮ⅡA（5 mg/kg）；中剂量治疗组造模，腹腔注射丹参酮ⅡA（10 mg/kg）；高剂量治疗组造模，腹腔注射丹参酮ⅡA（20 mg/kg）；TLR4 为Toll 样受体4；MyD88 为髓样分化因子88；NF-κB 为核转录因子-κB；HMGB1 为高迁移率族蛋白B1；与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别假手术组模型组低剂量治疗组中剂量治疗组高剂量治疗组F 值P 值鼠数55555 TLR4 1.00±0.23 2.25±0.35a 1.85±0.20c 1.54±0.12c 1.29±0.18c 40.024＜0.001 MyD88 1.00±0.28 2.59±0.28a 2.14±0.26b 1.78±0.28c 1.52±0.29c 42.128＜0.001 NF-κB 1.00±0.28 1.87±0.29a 1.63±0.13 1.35±0.09c 1.09±0.30c 21.227＜0.001 HMGB1 1.00±0.19 2.06±0.22a 1.72±0.10c 1.45±0.10c 1.26±0.27c 42.049＜0.001

3 讨 论

HMGB1 是在脓毒症发生发展过程中起“警报性”作用的蛋白，当发生炎症反应时，其可进一步促进炎症因子的分泌[6]。Li 等[7]研究表明，HMGB1 水平升高趋势与脓毒症疾病严重程度相关性极强。TLR4是HMGB1 参与机体炎症反应的受体，当发生炎症反应时，HMGB1 激活TLR4[8-9]。TLR4 被激活后，可通过MyD88 来靶点NF-κB，产生炎症“瀑布”样效应[10-11]。Yao 等[12]研究表明，肺损伤与TLR4 活化有关，释放到细胞外的HMGB1 主要识别并结合TLRs等受体，MyD88 是TLRs 信号通路的关键接头蛋白，启动相应的信号转导通路，激活的TLR4 能够通过下游MyD88/NF-κB 通路，使大量炎症介质释放，引起肺损伤。

丹参酮ⅡA 目前在临床治疗上比较常见，是一种性质稳定，有效成分利用率高，药理作用广泛，分子结构明确的黄酮类化合物，已有研究发现其具有改善心血管动脉硬化、增加冠脉血流量、抗肿瘤、抗脏器纤维化、抗炎、改善气道功能等作用[13-14]。本研究结果显示，中、高剂量治疗组肺组织W/D 显著减小，TLR4、MyD88、NF-κB、HMGB1 mRNA 的表达下调。低、中、高剂量治疗组大鼠肺组织较模型组大鼠肺组织损伤明显减轻。

综上所述，丹参酮ⅡA 可能通过下调HMGB1 表达，抑制TLR4/MyD88/NF-κB 通路，减少炎症因子释放，从而保护肺组织，为脓毒症肺损伤的临床治疗提供新的思路。