HPLC- RID法测定海藻碘液中甘露醇的含量

易守福,岳元媛,王 茹,王 琼,周雪琪,唐 雄,谢丹丹

(雪天盐业集团股份有限公司,湖南省井矿盐工程技术研究中心,湖南 长沙 430004)

海藻碘液是一种以海带为原料,经水浸提、净化、浓缩、杀菌等工序加工制成的食品营养强化剂[1],兼具无机碘和有机碘的优点,与碘酸钾、碘化钾一同被作为碘营养强化剂应用于加碘食盐中[2]。目前,添加海藻碘的海藻碘盐作为新一代的具有健康理念的碘盐产品,逐渐被人们所认识和接受。甘露醇,又称D-甘露糖醇,为六元醇,是无色或白色的结晶性粉末,具有清凉甜味,为良好的脱水利尿药[3],可治疗颅脑疾患、老年嗜睡症、眼科病、肺心病、心脏衰竭等疾病,也常用于治疗急性肾功能衰竭的尿闭症[4-6]。GB 1903—2018 《食品安全国家标准 食品营养强化剂 海藻碘》对海藻碘液中甘露醇的含量具有明确要求,是判定海藻碘液质量的一项重要指标。

目前,甘露醇的测定方法主要有氧化还原滴定法[1,7]、分光光度法[8-9]、离子色谱法[10-11]、高效液相色谱法和质谱法[12-16]。海藻碘液中甘露醇含量主要采用氧化还原滴定法测定,但氧化还原滴定法操作繁琐,且海藻碘液为海带或海藻的浸提浓缩液,基质复杂,易对滴定结果产生干扰。采用液相色谱法测定海藻碘液中甘露醇含量的方法暂未见报道,该研究将采用高效液相色谱仪,结合示差折光检测器,通过优化前处理过程和色谱条件,为海藻碘液中甘露醇的测定提供快速的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1260):安捷伦科技(中国)有限公司;电子分析天平(ES-E120B):天津市德安特传感技术有限公司;电子分析天平(XP205):梅特勒托利多科技(中国)有限公司;离心机(L530):湖南湘仪离心机仪器有限公司。

D-甘露醇(98.5%):北京坛墨质检科技有限公司;乙腈(色谱纯):上海安谱实验科技股份有限公司;乙酸锌(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;亚铁氰化钾(分析纯):国药集团化学试剂有限公司。

样品:相关生产企业提供。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱,Agilent Polaris NH2色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相,体积比70 ∶30;流速,1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测器,示差折光检测器;进样量:20 μL。

1.2.2 标准溶液的绘制

标准储备液的配制:精密称取D-甘露醇标准品100 mg(精确至0.01 mg),置于10 mL容量瓶中,用超纯水溶解,并稀释至刻度,摇匀,得到10 mg/mL的标准储备液。

标准工作液的配制:精密量取甘露醇标准储备液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别置于10 mL容量瓶中,用超纯水稀释至刻度,摇匀,得到0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/mL的标准工作液。

1.2.3 样品处理

准确称取1.0 g(精确至0.000 1 g)海藻碘液于100 mL容量瓶中,加水约50 mL溶解,缓慢加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各5.0 mL,加水定容至刻度,摇匀后取10 mL样品溶液离心获取上清液,过0.45 μm 微孔滤膜至样品瓶,供液相色谱分析。

1.2.4 加标样品处理

准确称取1.0 g(精确至0.000 1 g)海藻碘液于100 mL容量瓶中,加入适量甘露醇标准溶液,加水约50 mL溶解,缓慢加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各5.0 mL,加水定容至刻度,摇匀后取10 mL样品溶液离心获取上清液,过0.45 μm 微孔滤膜至样品瓶,供液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

由于甘露醇易溶于水,因此可以直接称取海藻碘液样品,用水稀释。但海藻碘液中富含海藻糖、可溶性海藻淀粉、蛋白质等大分子有机物,如果不进行沉淀、过滤处理,容易造成液相色谱系统的堵塞。考察了两种不同的蛋白沉淀剂,亚铁氰化钾—乙酸锌溶液和亚铁氰化钾—硫酸锌溶液。结果表明:亚铁氰化钾—乙酸锌溶液沉淀效果更好,能有效去除杂质,过微孔滤膜更加流畅,色谱图中没有杂峰干扰。

2.2 色谱柱的选择

甘露醇属于极性较大的物质,在反相C18类型的色谱柱中较难保留,因此选用了适合分析糖类和多元醇类分析的氨基柱。考察了不同品牌的氨基色谱柱的分离效果,结果显示不同品牌的色谱柱对各甘露醇的保留时间和响应值有所不同,但色谱峰都可达到较好的分离效果,该方法选择响应值较好的Agilent Polaris NH2色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)为分析柱。

2.3 色谱条件的优化

保持其它色谱条件不变,对流动相乙腈和水的体积比进行优化,考察了流动相乙腈与水的体积比组成分别为60 ∶40,70 ∶30,80 ∶20的三个样品。当乙腈比例为60%时,甘露醇出峰时间较快,样品中的目标峰附近存在杂峰干扰,无法准确定量;乙腈比例为80%时,保留时间延长,峰宽变宽,且目标组分的保留降低,峰的响应值下降;而乙腈比例为70% 时,保留时间为6.8 min,样品中的目标峰与杂峰分离效果较佳。在此条件下,进一步考察了流速和柱温对样品分离效果的影响,当改变流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)时,随着流速的提高, 保留时间缩短,峰宽逐渐变小,峰型渐佳,确定流速为1.0 mL/min。同时在流动相为乙腈与水体积比为70 ∶30、流速为1.0 mL/min的条件下分别考察了30、35、40 ℃等柱温条件,实验结果表明柱温对样品的分离度和保留时间基本无影响,考虑到柱子使用寿命,选择柱温为30 ℃。标准溶液及样品溶液中甘露醇的色谱图见图1 。

图1 甘露醇高效液相色谱图Fig.1 HPLC Chromatograms of Mannitol

2.4 线性关系、检出限和定量限

配制甘露醇质量浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/mL的标准系列工作液,按上述优化的色谱条件进样分析,以甘露醇的峰面积为纵坐标,相应的质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,所得曲线线性关系良好,相关系数R2为0.999 8;以3倍信噪比计算检出限为0.16 g/100 g,以10倍信噪比计算定量限为0.5 g/100 g,结果见表1。甘露醇质量浓度在0.1～5.0 mg/mL的范围内,线性关系良好。

表1 线性方程、相关系数、检出限和定量限Tab.1 Linear equations, correlation coefficients, limit of detection(LOD) and limit of quantification(LOQ)

2.5 加标回收率和精密度

称取已知甘露醇含量的海藻碘液18份,分为3组,按照样品中甘露醇含量约50%、100%、150%三个水平进行加标回收,每个浓度水平平行测定6次,分别计算平均回收率和相对标准偏差,见表2。三个浓度水平加标回收率分别为97.2%、98.5%和98.8 % ,RSD分别为2.6 %、1.2 %和2.0 %,回收率和精密度均满足GB/T 27404—2008 的要求。

表2 回收率和相对标准偏差Tab.2 Recoveries and standard deviations

2.6 实际样品测定及与国标方法的比较

对7批次不同生产厂家生产的海藻碘液进行甘露醇含量测定,并与采用GB 1903—2018测定的结果进行比较,检测结果见表3。所有样品中的甘露醇含量均符合标准限量(≥7.0 g/100 g)的要求,不同产品中甘露醇含量存在较大的差异。通过对此法测定结果与国标法测定结果比较发现,两个方法测定的结果差异较小,表明液相法能准确地测定海藻碘液中甘露醇的含量。

表3 海藻碘液中甘露醇的测定结果(n=2)Tab.3 Results of Mannitol in seaweed iodine concentrate solution (n=2)

3 结论

实验采用高效液相色谱—示差检测器,利用乙腈和水(体积比70 ∶30)为流动相,以外标法定量,建立了海藻碘液中甘露醇含量的测定方法。甘露醇在0.1～5.0 mg/mL浓度范围内,线性关系良好,相关系数R2为0.999 8;加标回收率为97.2%～98.8%,相对标准偏差(RSD)小于3.0%。相比GB 1903—2018中的检测方法,该法操作简单,准确度好,精密度高。该法适用于海藻碘液中甘露醇含量的测定,可为海藻碘液的质量控制提供可靠的检测手段。