羟基红花黄色素A 抗缺氧/复氧所致神经元损伤的作用及机制研究*

贾晓旭，张怡博，袁庆，王硕，朱金墙

（1．鄂尔多斯中医医院药剂科，鄂尔多斯 017010；2．天津中医药大学，天津 301617；3．天津中医药大学中医药研究院，组分中药国家重点实验室，天津 301617）

缺血性脑血管疾病严重危害着人类的生命健康，及时恢复血流以实现再灌注是目前最常用的治疗策略，但该策略在挽救患者生命的同时又会产生新损伤，即脑缺血再灌注损伤（CIRI）[1]。CIRI 是一种复杂的级联反应性病理生理过程，涉及多种发病机制。研究表明，CIRI 可损伤神经元轴突及突触结构，进一步导致海马、大脑皮层等部位神经元死亡[2-3]。因此，神经元突触重塑在减轻CIRI 以及神经组织修复方面发挥重要作用。

具有多环节、多靶点、多途径等作用特点的中药在防治CIRI 方面具有独特的作用[4]。中药红花（Carthamus tinctorius L．）具有通络活血、祛瘀止痛的功效，常用于心脑血管疾病（如高血压病、冠心病、脑血栓）的辅助治疗，其主要活性成分为水溶性成分红花黄色素（SY），其中羟基红花黄色素A（HSYA）为红花黄色素中含量较高的成分[5]。药理研究表明，HSYA 能抗兴奋性毒性、抗氧化应激、抗凋亡、抗炎、保护血脑屏障和调节自噬，还能促进突触可塑性，从而发挥抗CIRI 的作用[6-7]。Yu 等[8]研究发现HSYA 可增强大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠基底兴奋性突触传递，并诱导海马长时程增强（LTP），增加脑源性神经生长因子（BDNF）和GluN2B 的表达，增强突触可塑性，但是对CIRI 后神经元突触重塑的作用机制尚未研究。

本研究体外原代培养皮层神经元，建立缺氧/复氧（H/R）损伤模型模拟CIRI，通过考察HSYA 对H/R 损伤后神经元活力及乳酸脱氢酶（LDH）的影响，明确其神经保护作用；并考察HSYA 对H/R 损伤的神经元中BDNF、生长相关蛋白43（GAP-43）以及NogoA mRNA 和蛋白表达的影响，初步探讨HSYA抗H/R 所致神经元损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar 大鼠16 d 孕鼠，清洁级，由天津中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物与主要试剂 HSYA（天津一方科技有限责任公司，中国），DMEM/F12 培养基、B-27（GIBCO 公司，美国），胰酶1∶250（Ameresco 公司，美国），胎牛血清（FBS，HYCLONE 公司，美国），LDH 检测试剂盒（北京中生生物工程高技术公司，中国），四甲基偶氮唑盐（MTT），二甲基亚砜（DMSO）、多聚赖氨酸（SIGMA 公司，美国），青霉素、链霉素（市售分析纯）、Trizol（上海生工生物技术有限公司）、逆转录试剂盒、聚合酶链反应（PCR）试剂盒（宝生物工程有限公司）；BDNF、GAP-43 及Nogo-A 酶联免疫试剂盒（R&D 公司），丙三醇、氯仿、无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂厂），BDNF、GAP-43 及Nogo-A mRNA的上、下游引物（上海生工生物技术有限公司）。

表1 引物序列Tab.1 Primers Sequence

1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱（THERMO，FORMA3111 型，美国），倒置相差显微镜（LEIClADMIL，德国），三气培养箱（MODEL 3131，THERMO，美国），酶标仪（Multiskan Ascent，THERMO LABSYSTEMS，美国），微量多功能读板机（NanoQuant，infinite M200，瑞士），ABI 7300 型实时荧光定量PCR 系统（Applied Biosystems，美国）。

1.4 方法

1.4.1 神经元原代培养 参照本课题组前期实验方法[9]，取怀孕16 d 的Wistar 大鼠，颈椎脱臼处死，用75%医用酒精浸泡3～5 min，于无菌条件下取出胚胎大脑皮层，剔除脑膜及大血管。将皮质剪碎约1 mm3大小，加入适量0．25%胰蛋白酶，37 ℃消化5 min。立即加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12 培养液终止消化，并将组织完全吹散。经75 μm筛网过滤，收集滤液；800 r/min 离心10 min（本研究所用离心机半径均为13 cm），弃上清，收集沉淀。用含体积分数10%FBS 的DMEM/F12 培养液将细胞重悬。调整细胞密度至1×106/mL，接种于预先涂有0．01%多聚赖氨酸的培养板中，置于培养箱培养4 h后，置换为无血清DMEM/F12 培养液（含体积分数2%B-27，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素）。以后，每2 d 半量换液1 次，细胞生长至第7 天时可用于实验。

1.4.2 实验分组及给药 取接种于6 孔或者96 孔细胞培养板中的神经元，每组设平行6 孔，随机分为正常对照组、H/R 组、羟基红花黄色素A 低（5 μg/mL）、中（20 μg/mL）、高（80 μg/mL）剂量组，具体处理方法如下。正常对照组：置换无血清培养液继续培养48 h，不做H/R 处理；H/R 组：置换无血清培养液，将培养板放入体积分数分别为0．94 N2、0．05 CO2、0．01 O2的三气培养箱中缺氧孵育24 h，再于体积分数分别为0．95 空气、0．05 CO2条件下复氧孵育24 h；HSYA 低、中、高剂量组：分别置换为含5、20、80 μg/mL HSYA 的无血清培养液，H/R 处理同H/R 组。

1.4.3 指标检测

1.4.3.1 噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力 取接种于96 孔板的神经元，收集培养上清液（用于LDH 检测），将MTT 液按0．5 mg/mL 的浓度加入100 μL/孔，继续孵育4 h 后，倒置显微镜下可见活细胞处有大量紫蓝色针状结晶，弃上清，加DMSO 100 μL/孔溶解后，酶标仪上读取OD 值，波长为570 nm。

1.4.3.2 LDH 试剂盒检测细胞上清液中LDH 活性 取细胞上清液，按照试剂盒说明书方法操作，以全自动生化分析仪测定LDH 活性。

1.4.3.3 RT-PCR 检测BDNF、GAP-43 及Nogo-A mRNA 表达水平 取接种于6 孔板的神经元，弃培养液，用冷磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗2 次，每孔加入1 mL 裂解液TRIzol，反复吹打，室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加0．2 mL 氯仿，剧烈振荡，室温放置15～30 min 后，于4 ℃12 000 r/min离心15 min，将水相转移到新的无RNase 的离心管中，缓慢加入1 倍体积-20 ℃保存的丙三醇，混匀，置-20 ℃2 h 以上，充分沉淀RNA。4 ℃10 000×g 离心10 min，弃上清。沉淀加入75%乙醇1 mL，重新悬浮，4℃8 000×g 离心10 min，弃上清。在超净台内室温挥发5 min，加入适量无RNnase 水轻轻吹打沉淀，使之溶解，用紫外分光光度法检测RNA 样品的浓度及纯度。反转录，应用ABI 7300 实时定量PCR仪分析软件进行分析，获得每个样品每次反应的CT值，计算得到其△CT，进行数据统计[10]。

1.4.3.4 ELISA 检测BDNF、GAP-43 及Nogo-A蛋白表达水平 收集各组上清液，1 000 r/min 离心10 min。将50 μL 标准品、50 μL 样品加入相应反应孔，立即加入50 μL 的生物素标记的抗体，混匀，37 ℃温育1 h，洗板3 次，每孔加入60 μL 的亲和链霉素-HRP，37 ℃温育30 min，洗板3 次，每孔加入底物A、B 各50 μL，混匀30 s，封板，37 ℃避光温育10 min，每孔加入终止液50 μL，立即于450 nm 波长处检测，根据标准曲线方程计算浓度。

1.5 统计学方法 运用SPSS 20．0 软件包进行数据处理，所有数据采用均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。P＜0．05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HSYA 对缺氧/复氧损伤神经元活力的影响 与正常对照组比较，H/R 组神经元活力显著降低（P＜0．01）；与H/R 组比较，HSYA 低、中、高剂量组神经元活力均显著增强（P＜0．01）。见图1。

图1 不同浓度HSYA 对缺氧/复氧损伤神经元活力的影响（±s，n=6）Fig.1 Effect of different concentrations of HSYA on neuronal viability after hypoxia/reoxygenation injury（±s，n=6）

2.2 HSYA 对缺氧/复氧损伤神经元LDH 释放的影响 与正常对照组比较，H/R 组神经元LDH 释放明显增加（P＜0．05）。与H/R 组比较，HSYA 低、中、高剂量组神经元LDH 释放均显著减少（P＜0．01）。见图2。

图2 不同浓度HSYA 对缺氧/复氧损伤神经元LDH 释放的影响（±s，n=6）Fig.2 Effect of different concentrations of HSYA on LDH release in neurons with hypoxia/reoxygenation injury（±s，n=6）

2.3 HSYA 对H/R 损伤神经元中BDNF、GAP-43及Nogo-A mRNA 表达的影响 与正常对照组比较，H/R 组BDNF 及GAP-43 mRNA 表达均显著降低（P＜0．05），Nogo-A mRNA 表达显著增加（P＜0．01）；与H/R 组比较，HSYA 低、中、高剂量均可显著促进BDNF mRNA 表达（P＜0．05 或P＜0．01），且抑制Nogo-A mRNA 表达（P＜0．05 或P＜0．01）；HSYA 中、高剂量可显著促进GAP-43 mRNA 表达（P＜0．05 或P＜0．01）。见图3、4、5。

图3 HSYA 对H/R 损伤神经元的BDNF mRNA 表达的影响（±s，n=6）Fig.3 Effect of HSYA on BDNF mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

图4 HSYA 对H/R 损伤神经元的GAP-43 mRNA 表达的影响（±s，n=6）Fig.4 Effect of HSYA on GAP-43 mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

图5 HSYA 对H/R 损伤神经元的Nogo-A mRNA 表达的影响（±s，n=6）Fig.5 Effect of HSYA on Nogo-A mRNA expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

2.4 HYSA 对H/R 损伤CNC 的BDNF、GAP-43 及Nogo-A 蛋白表达水平的影响 与正常对照组比较，H/R 组BDNF、GAP-43 蛋白表达均显著降低（P＜0．05），NogoA 蛋白表达水平显著提高（P＜0．01）；与H/R 组比较，HSYA 低、中、高剂量均可显著降低BDNF 蛋白表达水平（P＜0．05），且抑制Nogo-A 蛋白表达（P＜0．05 或P＜0．01）；HSYA 中、高剂量可显著促进GAP-43 mRNA 表达（P＜0．05）。见图6、7、8。

图6 HYSA 对H/R 损伤神经元BDNF 蛋白表达的影响（±s，n=6）Fig.6 Effect of HYSA on BDNF protein expression in H/R injured neurons（±s，n=6）

图7 HYSA 对H/R 损伤神经元GAP-43 蛋白表达的影响（±s，n=6）Fig.7 Effect of HYSA on the expression of GAP-43 protein in H/R injured neurons（±s，n=6）

图8 HYSA 对H/R 损伤神经元Nogo-A 蛋白表达的影响（±s，n=6）Fig.8 Effect of HYSA on the expression of Nogo-A protein in H/R injured neurons（±s，n=6）

3 讨论

CIRI 最核心的问题是神经元损害引起的神经功能障碍，因此，保护和恢复受损神经元的功能成为治疗CIRI 最重要的任务[11]。近年来，诸多学者认为其治疗靶点不应仅仅局限于抵抗损伤的因素，而更应该着眼于内源性的神经保护机制和长期的恢复过程[12]。

神经营养因子可诱导、调节和控制神经元的生存、生长、迁移以及与其他细胞建立功能性联系，并在神经再生过程中促进轴突的再生长。神经营养因子（NTFs）是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质，主要分为：1）神经营养素（NT）家族，包括神经生长因子（NGF）、BDNF、神经营养因子-3（NT-3）、神经营养因子-4/5（NT-4/5）等。2）胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。3）睫状神经营养因子（CNTF）。这些蛋白质已经成为治疗神经损伤等疾病的潜在药物标靶。其中BDNF 是体内含量最多的神经营养因子。BDNF 是从猪脑脊液中发现的一种具有神经营养作用的碱性蛋白质，BDNF 及其受体在神经系统广泛表达，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。它通过与酪氨酸激酶受体B（TrkB）的结合而发挥作用，对神经元的生存、分化、生长和神经元正常生理功能具有维持和促进作用，而且还有增加突触可塑性及神经再生等作用[13]。本研究结果显示，HSYA 可有效抑制H/R 引起的LDH 释放，明显增加神经元细胞活力，表明HSYA 能有效减轻H/R 引起的神经元损伤。为了探究其作用机制，本研究进一步考察了HSYA 对神经元表达及分泌BDNF 的影响，结果表明HSYA 可有效促进神经元释放BDNF。

此外，BDNF 还可以促进突触成熟，增加突触可塑性[14-15]。因此，本研究进一步考察HSYA 是否可以通过促进BDNF 表达而增加神经元突触可塑性。GAP-43 是存在于神经元轴突生长锥中的一种特异性胞膜磷酸蛋白，广泛分布于大脑、小脑、脊髓、背根节以及自主神经系统的神经元内。在发育中的神经元内，沿整个轴突表达，在生长锥表达尤其丰富；而在成熟神经系统，主要分布于某些特定区域的神经终末中，在促进神经细胞生长、轴突再生和突触重构等方面发挥重要作用，已成为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针[16-17]。Nogo-A 是一种氨基酸的膜蛋白，是有效的轴突生长抑制因子，不仅表达于少突胶质细胞，还广泛表达于神经元，是反映神经损伤后是否可再生的指标之一[18-19]。在生理状态下，Nogo-A 对生长较迟的神经纤维起到约束的作用，神经纤维只能进入特定的区域层内。在成年哺乳动物中枢神经系统中，Nogo-A的主要作用是保持中枢神经系统微环境的稳定，防止不必要的出芽，有助于保持神经联系的特异性，防止形成不必要的、错误的投射，通过微管动力学调节参与轴突生长和树突塑形的进程。Nogo-A 与其他生长抑制因子和神经生长促进因子呈平衡状态，当出现外界刺激后，其内部平衡被破坏，Nogo-A呈现抑制作用[20-21]。以上两种蛋白均可一定程度地分泌到细胞外。本研究考察了HSYA 对神经元内GAP-43 和Nogo-A mRNA 以及细胞上清液中二者蛋白含量的影响，结果显示，HSYA 可促进GAP-43 mRNA 及蛋白表达，同时抑制Nogo-A mRNA 及蛋白表达，表明HSYA 能有效增加神经元突触可塑性。

本研究初步表明HSYA 抗H/R 损伤神经元的作用机制可能是通过促进BDNF 表达而改善神经元生存状态，并增加神经元突触可塑性。但该作用还有待从神经元突触微观形态学角度来进一步验证，其作用机制亦有待围绕BDNF/酪氨酸激酶B（TrkB）、Nogo-A/Nogo-A 受体（NgR）等信号通路进行深入探讨。