保肾通络方抑制DN 小鼠肾小球炎症和系膜基质增生减轻肾脏损伤机制研究*

崔方强，王悦芬，蔡朕，孟元，江心灿，赵文景

（首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010）

糖尿病肾病（DN）已经成为中国终末期肾病（ESRD）及透析患者的主要原发肾脏疾病[1]，但目前针对DN 发病的关键病理机制缺少相对应的治疗措施。研究表明，肾小球炎症介导的系膜基质增生是DN 发生及进展的重要病理机制[2]。而抑制炎症减轻系膜基质增生可能成为DN 治疗的潜在靶点[3]。中医药在防治DN 方面具有独特的优势，保肾通络方为首都医科大学附属北京中医医院肾病科临床经验方，被广泛应用于临床防治DN。保肾通络方治疗DN 临床疗效确切，但其防治DN 的分子机制目前尚不清楚。因此本研究观察了保肾通络方对于DN 小鼠肾脏病理损伤、肾小球细胞外基质蛋白Ⅳ型胶原蛋白（Collagen Ⅳ）及纤连蛋白（FN）、肾小球炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）水平的影响，进而探讨其防治DN 的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 本研究应用的KK-Ay 小鼠及C57BL/6J 小鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，其中KK-Ay 小鼠30 只，C57BL/6J 小鼠10 只，所有小鼠均为8 周龄SPF 级雄性，体质量为（25±5）g，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0004。小鼠在12 h 光照/黑暗循环，温度（24±1）℃，湿度50%～70%条件下饲养，并可自由进食进水。本研究已通过实验动物伦理委员会批准，动物造模及实验过程严格遵守动物福利伦理原则。

1.2 试剂和药物 Collagen Ⅳ抗体（ab6586，abcam，英国）、FN 抗体（ab2413，abcam，英国）、糖原（PAS）染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司，C0142M）、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司，C0105S）、Masson 染色试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司，G1006）、IL-6 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，ml023130）、TNF-α、酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，ml077385）、尿蛋白定量检测试剂盒（南京建成，C035-2）、肌酐测定试剂盒（ROCHE，瑞士，657881）、尿素氮测定试剂盒（ROCHE，瑞士，658513）、缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司，批号：X1440）；保肾通络方颗粒剂，由首都医科大学附属北京中医医院药剂科制备。

1.3 主要仪器 酶标仪（北京市新风机电技术公司，ZS-3）、离心机（美国Sigma，3K18）、全自动生化分析仪（上海科华生物工程股份有限公司，ZY1280）、倒置显微镜（德国Leica 公司，DMILPH1）、凝胶化学发光成像分析系统（法国Vilber 公司，FUSION FX6 XT）、高电流电泳电源（美国伯乐公司，1645052）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型建立及分组给药 首先建立DN 小鼠模型，8 周龄雄性KK-Ay 小鼠予高脂饲料喂养，C57BL/6J 小鼠予普通饲料饲养。4 周后检测各组小鼠血糖及24 h 尿蛋白定量。当KK-Ay 小鼠血糖≥16．7 mmol/L，并且24 h 尿蛋白明显高于C57BL/6J小鼠时，DN 小鼠模型造模成功。DN 小鼠以血糖、24 h尿蛋白定量并结合体质量进行分层，随机分为模型组、保肾通络方组及缬沙坦组，另外将C57BL/6J 小鼠作为正常对照组，每组10 只。保肾通络方予保肾通络方颗粒剂灌胃，灌胃剂量为20 g/（kg·d）（生药剂量），缬沙坦组予10 mg/（kg·d）缬沙坦灌胃，其余两组予等剂量蒸馏水灌胃，连续灌胃12 周。

1.4.2 标本采集与处理 于灌胃0、4、8 和12 周收集小鼠24 h 尿液，检测尿蛋白水平。灌胃结束后，小鼠予戊巴比妥麻醉，心尖取血，静置20 min 左右，离心半径8 cm，2 000 r/min 离心20 min，分离血清，后检测血肌酐及尿素氮水平。摘取肾脏组织，一部分肾组织放入4%多聚甲醛固定，然后石蜡包埋切片，用于免疫组化及肾脏病理检测，另外部分放入-80 ℃冰箱，用于逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测及ELISA 检测。

1.4.3 HE、PAS 染色 将石蜡切片进行脱蜡处理，然后将切片放入伊红或无色盐基性品红溶液对切片进行染色，染色结束后流水冲洗，后用苏木精对细胞核进行染色，程序性脱水透明后，封片，光镜下观察肾脏病理改变。

1.4.4 Masson 染色 将石蜡切片进行脱蜡处理，Weigert 铁苏木素染色液染核5～10 min，1%盐酸酒精分化5～15 s，充分水洗，丽春红酸性品红液染5～10 min，用苯胺蓝液复染5 min，程序性脱水透明后，封片，光镜下观察肾脏病理改变。

1.4.5 酶联免疫法检测 将各组小鼠肾组织用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，放置在冰上匀浆，应用离心机4 ℃、12 000×g、离心10 min，取离心后的上清液，应用BCA 蛋白定量试剂盒测定上清液总蛋白浓度，根据ELISA 试剂盒说明书操作步骤对肾组织中的IL-6、TNF-α 水平进行检测。

1.4.6 免疫组化 首先将石蜡切片脱蜡，然后将一抗稀释成特定浓度（Collagen Ⅳ1∶1 000；FN 1∶1 000），一抗稀释液滴加到不同组别切片上，4 ℃孵育过夜，后流水冲洗，加入二抗37 ℃孵育1 h，用苏木精进行染核，封片。光镜下观察蛋白表达水平。

1.4.7 RT-PCR 首先对肾脏总RNA 进行提取，然后将mRNA 反转录成为cDNA，对cDNA 进行扩增和荧光定量分析。采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析，所有操作均按照产品说明书进行。利用Primer 5．0 软件设计引物序列，见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.5 统计学方法 采用SPSS20．0 进行统计处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），多重比较采用LSD 检验，P＜0．05 表示有统计学差异。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态比较 正常对照组小鼠毛发光泽，对外界刺激反应灵敏，精神状态良好；而模型组小鼠毛色晦暗，反应迟钝，精神萎靡，并出现多饮和形体消瘦；而保肾通络方组和缬沙坦组小鼠一般状态均较模型组有不同程度的改善。

2.2 保肾通络方对DN 小鼠24 h 尿蛋白水平的影响 正常对照组小鼠24 h 尿蛋白水平在整个实验期间均维持在低水平。与正常对照组相比，模型组小鼠在不同时间节点其24 h 尿蛋白水平均有不同程度升高（P＜0．05），并且随着时间延长，其尿蛋白水平呈现逐渐升高的趋势。与模型组相比，保肾通络方及缬沙坦组小鼠在灌胃4、8 和12 周其24 h 尿蛋白水平均有明显下降（P＜0．05）。见图1。

图1 各组小鼠不同时间点24 h 尿蛋白的比较（n=10）Fig.1 Comparison of 24 h proteinuria from mice in different groups（n=10）

2.3 保肾通络方对DN 小鼠血肌酐、尿素氮水平影响 模型组小鼠血肌酐及尿素氮水平较正常对照组明显升高（P＜0．05）；与模型组相比，保肾通络方组及缬沙坦组小鼠血肌酐、尿素氮水平均有明显下降（P＜0．05）。见图2。

图2 各组小鼠血肌酐（A）及血尿素氮（B）水平比较（±s，n=10）Fig.2 Comparison of Scr(A)and BUN(B)from mice in different groups（±s，n=10）

2.4 保肾通络方对DN 小鼠肾脏病理的影响 正常对照组小鼠肾小球系膜细胞较少，细胞外基质正常；与正常对照组相比，模型组小鼠肾小球系膜细胞明显增多，细胞外基质增生明显。与模型组相比，保肾通络方组及缬沙坦组小鼠肾小球系膜细胞减少，细胞外基质增生减轻。见图3。

图3 各组小鼠肾小球肾脏病理改变比较（×200）Fig.3 Comparison of renal pathology from mice in different groups(×200)

2.5 保肾通络方对DN 小鼠肾小球细胞外基质FN蛋白及mRNA 表达的影响 与正常对照组相比，模型组小鼠肾小球细胞外基质FN 蛋白及mRNA 表达明显上调（P＜0．05）；与模型组相比，保肾通络方组及缬沙坦组小鼠肾小球细胞外基质FN 蛋白及mRNA表达明显下调（P＜0．05）。见图4。

图4 各组小鼠足细胞FN 蛋白（A-B）及mRNA（C）表达水平的比较Fig.4 Comparison of FN protein(A-B)and mRNA(C)expression levels in mice podiocytes in each group

2.6 保肾通络方对DN 小鼠肾小球细胞外基质Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表达的影响 与正常对照组相比，模型组小鼠肾小球细胞外基质Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表达明显上调（P＜0．05）；与模型组相比，保肾通络方组及缬沙坦组小鼠肾小球细胞外基质Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表达明显下调（P＜0．05）。见图5。

2.7 保肾通络方对DN 小鼠肾组织TNF-α 及IL-6的影响 与正常对照组相比，模型组小鼠肾组织TNF-α 及IL-6 水平明显升高（P＜0．05）；与模型组相比，保肾通络方组及缬沙坦组小鼠肾组织TNF-α及IL-6 水平明显降低（P＜0．05）。见图6。

图6 各组小鼠肾组织IL-6（A）及TNF-α（B）水平比较（±s，n=10）Fig.6 Comparison of IL-6(A)and TNF-α(B)expression from mice in different groups（±s，n=10）

3 讨论

DN 发病率逐年升高，已经成为导致终末期肾病（ESRD）主要的原发肾脏疾病[4]。目前关于DN 的治疗取得了一些进展，包括应用钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT-2）抑制剂和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，但这些药物在中重度肾功能受损患者仍需减量或者停药[5]。此外尽管采取了以上积极早期的临床干预措施，仍有很多患者快速进入ESRD。因此积极探讨DN 的发病机制，进而寻求其潜在治疗靶点及新的治疗策略显得尤为重要。

肾小球系膜细胞增多及细胞外基质增生是DN特征性的病理改变[6]。其中细胞外基质增生是导致DN 肾小球纤维化及疾病进展的重要病理机制[7]。肾小球细胞外基质主要包括Collagen Ⅳ和FN，其中FN 是一种大分子糖蛋白，广泛存在于细胞外基质、基膜及体液中，并在细胞外基质中相互交叉，形成网络，为其他细胞外基质成分沉积提供支架[8]。Collagen Ⅳ是一种基膜胶原，存在于上皮细胞、血管内皮细胞基膜中。Collagen Ⅳ同时也是肾小球系膜基质及基底膜的主要成分，其在系膜细胞间相互交叉呈网状结构[9]。生理情况下，肾小球细胞外基质生成和降解处于动态平衡。在DN 中，肾小球系膜细胞外基质生成增多，降解减少，进而引起细胞外基质累积。而抑制肾小球细胞外基质蛋白FN 及Collagen Ⅳ生成，减轻细胞外基质增生可以有效的延缓DN 疾病进展[10]。

炎症介导肾小球系膜基质增生是DN 发生及进展的重要病理机制。DN 患者肾小球处于一种局部的、非显性的慢性低度炎症，并非由病原微生物引起，而是与多种致炎因子相关的免疫性炎症[11]。研究发现，高糖等病理因素会引起巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞在肾小球浸润，并释放相关炎性因子[12]。而炎性因子可作用于肾脏固有细胞，引起系膜细胞增殖及细胞外基质增生，进而引起肾小球纤维化，最终导致蛋白尿的产生及肾功能的进展[13]。其中IL-6 及TNF-α 是介导DN 肾小球炎症及系膜基质增生的重要炎性因子。研究发现，DN 患者IL-6 水平较无肾脏损伤人群明显升高，且随着IL-6 水平的升高，其肾小球系膜细胞基质增生呈现逐渐加重趋势[14]。TNF-α 不仅可以直接介导系膜细胞损伤，同时可以刺激成纤维细胞生长和局部胶原的增加，在肾纤维化中发挥作用[15]。

中医药在防治DN 方面具有独特的优势，并显示出较好的减轻炎症抑制系膜基质增生作用[16-17]。全国名老中医张炳厚教授长期从事中医药防治DN 的临床研究工作，提出“肾气精两虚，肾失封藏，肾络闭阻”是DN 发病的核心病机，并主张治疗糖尿病肾病应采用补肾活血通络的治疗原则。保肾通络方是在补肾活血通络的治则指导下组方而成，由黄芪、熟地黄、菟丝子、刘寄奴、鬼箭羽、水蛭、丹参组成，本研究在补肾药物基础上加入虫蚁通络药和辛润通络药。方中熟地黄滋阴补肾，重用为君药，黄芪健脾益气，菟丝子补肾涩精，三者配伍，共奏益气养阴、补益脾肾之效，加用丹参、刘寄奴、鬼箭羽活血化瘀通络，但糖尿病肾病肾络闭阻日久，单凭草木之力难以起效，加用水蛭加强通络之力。临床试验已经证实，保肾通络方对于DN 患者具有较好的降低尿蛋白、改善肾功能的作用[18]。此外基础实验证实，保肾通络方能够减轻DN 小鼠足细胞损伤，延缓疾病进展[19]。但是保肾通络方对DN 肾小球炎症及系膜基质增生的作用目前并不清楚。

因此，课题组进行了前期动物实验研究，设立了保肾通络方低、中、高剂量组，实验结果证实，中剂量组[20 g/（kg·d）]小鼠肾功能改善明显优于其他两个剂量组，因此本实验中保肾通络方的给药剂量为20 g/（kg·d）。研究结果显示保肾通络方能够显著降低DN 小鼠蛋白尿，降低DN 小鼠血肌酐、血尿素氮水平。此外保肾通络方可以降低DN 小鼠肾小球系膜细胞数目，减轻肾小球细胞外基质增生，改善肾脏病理。基于FN 及Collagen Ⅳ在DN 肾小球细胞外基质增生中的重要作用，本课题观察了不同组别小鼠肾小球FN 及Collagen Ⅳ的表达情况。结果显示，保肾通络方能够明显下调DN 小鼠肾小球FN及Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表达。与此同时，保肾通络方可以降低DN 小鼠肾组织炎性因子IL-6 及TNF-α 水平。本实验研究结果表明，保肾通络方能够降低DN 蛋白尿，保护肾功能。同时保肾通络方能够下调FN 和Collagen Ⅳ表达，降低炎性因子IL-6和TNF-α 水平，减轻肾小球炎症及系膜基质增生。至于其减轻DN 肾小球炎症和系膜基质增生的详细的分子机制有待进一步研究。