霍乱监测中4 号琼脂、TCBS 琼脂及庆大霉素琼脂优劣势对比

刘芷含

（浮梁县疾病预防控制中心检验科，江西 浮梁 333400）

霍乱（cholera）为我国法定甲类传染病之一，由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）感染所致，多伴有剧烈呕吐、腹泻等明显症状，可引发脱水、休克等不良后果，具有发病急、传播快、致死率高等特点，对国内外公共卫生安全均构成了较大威胁[1，2]。现如今，病原学诊断一直为我国疫情确诊报告金标准，其实验室检测结果可直接影响防疫管控工作的制定与开展，其中玻片凝集法（slide agglutination test）与胶体金法（colloidal gold method）均为霍乱弧菌常用检测方式，其培养基的选择在病株分离鉴定中具有重要意义[3，4]。目前，4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂均为致病性弧菌的选择性培养基，其平板制作及配方组成均存在一定差异，临床选择存在较大争议[5，6]。在此，本研究结合2022 年1 月-2023 年3 月浮梁县疾病预防控制中心检验科分离保存的霍乱弧菌株，观察4 号琼脂、TCBS 琼脂及庆大霉素琼脂在霍乱监测中的应用效果，以期为霍乱弧菌培养基的选择提供有效参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 选取2022 年1 月-2023 年3 月浮梁县疾病预防控制中心检验科分离保存的霍乱弧菌株，该菌株种类为O139 群霍乱弧菌，保存环境为-80 ℃，培养前经霍乱防治手册鉴定。

1.2 方法

1.2.1 培养基制作 4 号琼脂培养基：取4 号琼脂（生产编号：025030，广东环凯微生物科技有限公司，规格：250 g）53.5 g，置于1000 ml 蒸馏水中加热煮沸，充分溶解后，冷却至50 ℃左右，灭菌后倒平板，凝固后备用。TCBS 琼脂培养基：取TCBS 琼脂（生产编号：022041，上海研尊生物科技有限公司，规格：250 g）88 g，置于1000 ml 蒸馏水中加热煮沸，充分溶解后，冷却至50 ℃左右，灭菌后倒平板，凝固后备用。庆大霉素琼脂培养基：取庆大霉素琼脂（生产批号：2108271，北京陆桥技术股份有限公司，规格：250 g）56 g，置于1000 ml 蒸馏水中加热煮沸，充分溶解后，冷却至50 ℃左右，灭菌后倒平板，凝固后备用。

1.2.2 病菌培养 将初始霍乱弧菌接种碱性蛋白胨水（生产批号：20210610，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，规格：250 g）进行增菌培养，37 ℃增菌6～8 h 后，于其菌膜下表层取接种环培养物，分别接种于4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂3 种培养基中，每种培养基各设置10 个平板，采用生化培养箱（上海恒一科学仪器有限公司，型号LRH-150F），37 ℃培养18～24 h。

1.2.3 病菌检测 取培养物进行玻片凝集法与胶体金法检测。玻片凝集法：取培养基菌落与霍乱弧菌单克隆抗体（生产批号：20220301，郑州万泰生物科技有限公司，规格：4×1 支/盒）进行玻片凝集试验，若菌落10 s 内出现明显凝集颗粒，且在生理盐水中不凝集，则评定为阳性。胶体金法：采用霍乱弧菌检测试剂盒（生产批号：20220401，郑州万泰生物科技有限公司，规格：50 人份）进行检测，检测线与质控线均显示红色条杠，则评定为阳性。

1.3 观察指标 ①比较三种培养基成分；②比较霍乱弧菌在不同培养基中的菌落特征；③比较霍乱弧菌在不同培养基中的检测结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验；计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种培养基配方成分比较 4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂培养基配方成分存在一定差异，其中TCBS 琼脂培养基成分种类最多，但三者琼脂含量相同，其pH 值无差异（F=5.021，P=0.857），见表1。

表1 三种培养基配方成分比较（n，±s）

表1 三种培养基配方成分比较（n，±s）

2.2 霍乱弧菌在不同培养基中的菌落特征比较 霍乱弧菌在4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂中的菌落生长特征存在一定差异，见表2。

表2 霍乱弧菌在不同培养基中的生长特征

2.3 霍乱弧菌在不同培养基中的检测情况比较 霍乱弧菌检出率由高至低依次为4 号琼脂＞庆大霉素琼脂＞TCBS 琼脂（χ2=4.445，P=0.035），见表3。

表3 霍乱弧菌在不同培养基中的检测率比较[n（%）]

3 讨论

霍乱弧菌属于典型革兰氏阴性菌，呈弧形或逗点状，其血清群丰富，细菌运动活跃，存活时间较长，多发于免疫力低下人群，具有较高易感风险[7，8]。其中，O1 群与O139 群霍乱弧菌是引发霍乱的主要病原菌，二者可通过毒素共调菌毛（toxincoregulatedpilus，TCP）与霍乱毒素（choleratoxin，CT）的释放，引发急性肠胃道症状，对患者生命安全构成了极大威胁，其临床诊断尤为重要[9，10]。目前，玻片凝集法与胶体金法均为霍乱弧菌常用鉴定方式，其检测需从强选择性培养基中挑取可疑菌落，以完成病菌的快速测定，实现疫情的及时防控[11，12]。故，其培养基的选择将直接影响病菌鉴定的时效性与准确性，在疫情防控管理中具有重要意义。4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂均为分离霍乱弧菌的强选择性培养基，其菌落特征是识别病菌的重要依据，但其培养生长速度不同，菌落特征存在一定差异，对其病菌检出效果造成了一定影响[13，14]。

本研究结果显示，4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂培养基配方成分存在一定差异，其中TCBS 琼脂培养基成分种类最多，但三者琼脂含量相同，其pH 值无差异（P＞0.05），表明4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂培养基的部分配方存在差异，但其琼脂量与pH 值较为一致，均为固体碱性培养基。这是由于霍乱弧菌属于兼性厌氧菌，其在固体培养基中生长良好，且碱性环境下增殖更快，以上培养基均可为霍乱弧菌的生长提供良好条件[15，16]。其中，4 号琼脂与庆大霉素琼脂培养基的配方成分较为相近，二者均以蛋白胨、牛肉膏粉作为碳氮源、维生素及生长因子的主要来源，通过氯化钠维持渗透压平衡，其配方中的亚硫酸钠可刺激弧菌生长，并以琼脂作为培养基的凝固剂[17，18]。但在抑菌配方中，4 号琼脂培养基包括庆大霉素、十二烷基硫酸钠、猪胆汁粉与雷佛奴尔等成分，庆大霉素琼脂培养基则以庆大霉素、柠檬酸钠为主，其抑菌成分相对单一[19]。TCBS 琼脂培养基配方中，其蛋白胨、酵母膏粉、蔗糖可作为碳氮源、维生素与生长因子的主要来源，通过氯化钠维持渗透压平衡，刺激弧菌生长，并利用柠檬酸钠、胆酸钠、牛胆粉及硫代硫酸钠等成分抑制革兰氏阳性菌及大肠菌群的生长，其中硫代硫酸钠与柠檬酸铁可作为硫化氢产生的重要指示剂，麝香草酚兰则属于培养基pH 指示剂[20]。在其培养生长过程中，霍乱弧菌在4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂中的菌落生长特征存在一定差异，提示不同培养基的菌落生长速度存在一定差异。其中，4 号琼脂与庆大霉素琼脂培养基的菌落特征较为相近，这与其相似的培养基配方存在直接关联，而TCBS 琼脂培养基的菌落生长速度明显较慢，且在18 h 后出现两大绿色菌落，易导致误检及漏检的发生。本次检测结果中，霍乱弧菌检出率由高至低依次为4 号琼脂＞庆大霉素琼脂＞TCBS 琼脂（P＜0.05），可见4 号琼脂培养基的检测效果最佳，而TCBS 琼脂培养基的检测作用相对最弱。分析认为，4 号琼脂与庆大霉素培养基均含有亚硫酸钠与庆大霉素，前者可刺激弧菌生长，后者则可有效抑制革兰氏阳性菌与部分革兰氏阴性杂菌，其中4 号琼脂还包含十二烷基硫酸钠、猪胆汁粉与雷佛奴尔等成分，可进一步减少培养基杂菌对检测结果的影响，保证霍乱弧菌的检测准确性[21]。而TCBS 琼脂培养基的抗菌成分相对较少，仅通过枸橼酸钠、牛胆粉、牛胆酸钠抑制肠道菌及革兰氏阳性菌的生长，对霍乱弧菌的生长速度造成了一定影响，同时TCBS 琼脂的蔗糖成分相对较多，其蔗糖发酵菌的产生，可进一步干扰弧菌的鉴定，不利于病菌的准确检出[22]。

综上所述，4 号琼脂、TCBS 琼脂与庆大霉素琼脂培养基均可有效分离霍乱弧菌，实现病菌检测，其营养基成分不同、菌落生长表现各异，以4 号琼脂培养基的检出效果最佳。