龟甲提取物作为保健食品原料的安全性研究

张倩

龟甲可作为保健食品原料使用，龟甲提取物也已成为天然保健品市场上的重要原料。本实验以龟甲提取物为研究对象，通过小鼠急性经口毒性试验、90天经口毒性试验探究龟甲提取物的安全性，为龟甲原料的开发和利用提供数据基础。

一、材料与方法

1.主要材料。样品龟甲提取物是以水为溶剂提取制得的，成人（体重60kg）推荐剂量为1.0g/天，1.0g提取物相当于10g龟甲原料。

2.实验动物。SPF级昆明种小鼠、SD大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，雌雄分笼饲养于温度为20℃-24℃、湿度为40%-70%RH的SPF级实验室。

3.实验方法。参照GB 15193.1《食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序》、GB 15193.3《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》、GB 15193.13《食品安全国家标准 90天经口毒性试验》规定的方法，进行急性经口毒性试验及90天经口毒性试验。

（1）急性经口毒性试验。取20只SPF级昆明种小鼠，试验开始前禁食5h，自由饮水。按照限量法，设置龟甲提取物灌胃剂量为15.0g/kg·bw，将龟甲提取物用水做溶剂配置成浓度为0.25g/mL的受试液，以20mL/kg灌胃容量灌胃三次，连续灌胃小鼠14天，观察动物一般情况，记录生存状态及是否出现中毒表现、死亡情况等。实验结束，每只小鼠均处死大体解剖后进行病理组织学检查，并记录观察结果。

（2）90天经口毒性试验。取120只SPF级SD大鼠，实验设置龟甲提取物高、中、低（5.00g/kg·bw、3.33g/kg·bw、1.67g/kg·bw）三个剂量组，分别相当于成人推荐剂量的300、200、100倍。另设阴性对照组，每组20只，雌雄各半。阴性对照组和高剂量组均设实验中期及实验恢复期卫星组，每组10只，雌雄各半。采用灌胃给予的方式，灌胃体积为10mL/kg，各剂量组灌胃给予相应受试物，阴性对照组、阴性对照卫星组灌胃等体积蒸馏水，高剂量卫星组给予5.00g/kg·bw剂量受试物。实验大鼠单笼饲养，不干涉进食、饮水，连续灌胃90天，恢复期卫星组继续灌胃28天。在实验期间，每日观察并详细记录大鼠生长情况，每周称重，记录摄食量，以此计算大鼠食物利用率。在实验前期及实验末期，对龟甲提取物高剂量组、阴性对照组进行眼部检查；在实验中期，取卫星组大鼠进行尿常规检测，夜间禁食，采血进行血液学和血液生化指标检测；进入实验末期及恢复期，阴性对照组、各剂量组、恢复期卫星组大鼠均进行尿常规检测、血液学和血液生化检查，大鼠解剖后观察各脏器的大体改变，摘取心、肝等脏器进行称重，计算脏/体比，取脏器、腺体并固定、切片后进行组织病理学检查。

二、结果与分析

1.急性经口毒性试验。以经口灌胃剂量为15.0g/kg·bw的龟甲提取物，雌雄小鼠灌胃后未见明显中毒症状，全部小鼠无一例死亡。实验结束后，小鼠大体解剖结果未见任何异常，LD50>15.0g/kg·bw。根据GB 15193.3《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》中急性毒性（LD50）剂量分级，属实际无毒级。

2.90天经口毒性试验。（1）龟甲提取物对大鼠体重、进食量、食物利用率的影响。在90天喂养实验期间及28天恢复期间，各剂量组大鼠生长情况正常，未见异样，均未出现中毒表现，实验动物无死亡。在整个实验过程中，龟甲提取物各剂量组雌雄大鼠体重、进食量、食物利用率与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。说明龟甲提取物各剂量对雌雄大鼠体重、进食量、食物利用率无影响。

（2）龟甲提取物对血液学指标的影响。由表1-2可知，龟甲提取物各剂量组雌雄大鼠血液学指标均在实验室历史正常值范围内，且与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。在实验中期及恢复期，高剂量卫星组雌雄大鼠血液学指标也均在实验室历史正常值范围内，且与对照卫星组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。说明龟甲提取物各剂量对雌雄大鼠血常规指标无影响。

（3）龟甲提取物对血生化指标的影响。由表3-6可知，龟甲提取物各剂量组雌雄大鼠血生化指标均在实验室历史正常值范围内，且与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。在实验中期及恢复期，高剂量卫星组雌雄大鼠血生化指标也均在实验室历史正常值范围内，且与对照卫星组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。说明龟甲提取物各剂量对雌雄大鼠血生化指标无影响。

（4）龟甲提取物对实验大鼠眼部、尿常规的影响。在实验前和实验末期，对龟甲提取物高剂量组、阴性对照組雌雄大鼠进行眼部检查，结果表明，晶状体未见浑浊，眼部角膜、虹膜清晰，球结膜无水肿和充血，说明龟甲提取物对大鼠眼部无影响。在实验中期、实验末期及恢复期，分别检测各组大鼠尿常规，结果表明，各组大鼠尿液外观正常，潜血、葡萄糖、尿蛋白、尿液pH及密度均未见异常。

（5）龟甲提取物对大鼠脏器重量及脏/体比值的影响。各剂量组雌雄大鼠的脑、心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸/卵巢、附睾/子宫重量及脏体比与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

（6）龟甲提取物对大鼠病理学的影响。处死动物后，肉眼观察大鼠体表、外观未见异常改变，被毛光滑，无脱落，肛门周围无脓肿及分泌物，体内未见出血、积液等，主要脏器位置均无异常，亦无明显病变。通过系统解剖及镜下观察，剂量组雌雄大鼠部分脏器有轻微变化，但病变程度非常轻微，认为是大鼠自发性组织病理学改变，剂量组与阴性对照组中的病变程度和情况相似，与龟甲提取物没有相关性。28天恢复期结束，卫星组大鼠大体解剖亦未见异常，结果认为龟甲提取物不会引起大鼠脏器病理学改变和损伤。

三、结论

急性经口毒性实验以15.0g/kg·bw剂量龟甲提取物，14天观察期内未见异常，LD50＞15.0g/kg·bw，属实际无毒级。

在90天经口毒性试验过程中，各组大鼠生存状态良好，龟甲提取物对体重、进食量、食物利用率无影响，对大鼠血液学、血生化指标的变化没有影响，眼部及尿常规检查未发现异样，通过肉眼观察及大体解剖镜下观察，未见与受试龟甲提取物相关的病理学改变。长期服用龟甲提取物安全无毒，可长期食用。