不同辣椒栽培种的杂交亲和性比较及胚胎拯救体系建立

施二荣，胡能兵，隋益虎，袁友志，来喜月，王 勃

（1.安徽科技学院农学院 安徽凤阳 233100；2.安徽金泰种业有限公司 合肥 230031）

辣椒（Capsicum）为茄科辣椒属一年生草本植物[1]。目前，全球共有5 个辣椒栽培种（Capsicum annuumL.、Capsicum chinenseL.、Capsicum frutescensL.、CapsicumpubescensL.、CapsicumbaccatumL.）和20 多个野生种[2]，其中我国种植面积最大的是C.annuum，该栽培种具有产量高、适应性强等特点，但抗性差异较大；C.frutescens和C.chinense兼具辣度高、抗性强等特点，但其栽培条件受区域限制较大且产量很低。有研究表明，各辣椒栽培种种间杂交均存在不同程度的生殖障碍[3-4]。

种间杂交是拓宽辣椒栽培种遗传基础和创制种质资源的有效方式[5-6]。为了能有效创制新的辣椒种质资源，聚合更多的有益性状，前人结合胚胎拯救技术导入外源基因，拓宽主要栽培种的遗传背景。Sui 等[7]通过C.annuum7033×C.chinense7020获得F1杂种，并自交获得大量分离后代；Yoon 等[8]将炭疽病抗性从C.baccatum渗入到C.annuum，在C.annuum回交后代中筛选出了大量高抗炭疽病的改良植株。

近年来高辣、高抗已成为辣椒育种的重要方向之一[9]。辣度较高、抗逆性较强的C.chinense、C.frutescens由于产量低而在我国栽培面积始终较小。为了把高辣度、强抗逆和高产量相结合，笔者利用3 个栽培种辣椒进行远缘杂交，通过对杂交坐果率、胚萌发率、拯救时期以及F1幼胚生根效果等指标的观测，旨在建立一套系统的胚胎拯救技术体系，提高远缘杂交的成功率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料包含3 个辣椒栽培种（图1），即8 份C.annuumL.、8 份C.chinenseL.和1 份C.frutescensL.共17 份试验材料（表1），均来自于安徽科技学院辣椒种质资源库，于2022 年3 月种植于安徽科技学院种植科技园3 号温室，四周覆盖30 目防虫网，栽培期间进行正常的生产管理。

表1 用于远缘杂交的辣椒亲本信息Table 1 Capsicum parental information for distant hybridization

图1 3 个辣椒栽培种的典型图片Fig.1 Typical pictures of three Capsicum species

1.2 方法

1.2.1 种间杂交 不同辣椒材料进入盛花期后选配了18 对正反交组合（表2）。杂交授粉时选择适龄花蕾徒手去雄，授粉在晴天07：00 至10：30、15：30 至18：00 进行，授粉后挂牌标记，第2 天重复授粉1 次，授粉后14 d 统计坐果率。

表2 3 个栽培种辣椒种间杂交的正反交组合Table 2 Reciprocal interspecific hybridization combinations of Capsicum species

1.2.2 消毒及拯救（萌发）培养基筛选 授粉后第34 d，选取Ca4×Cc5 未成熟的F1幼胚在无菌组培室的洁净操作台上进行消毒处理，流水冲洗表面灰尘后用75% 的酒精进行果实表面消毒1 min，剖开果实内腔胎座及幼胚消毒30 s，再用0.1% 的氯化汞浸泡3 min，无菌水清洗3～5 次。将剥离的幼胚分别接种到MF0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂，pH 6.0）、MF1、MF2、MF3、MF4、MF5、MF6培养基上（表3），从而筛出最优萌发培养基。每个处理6 次重复，每瓶接种5 个幼胚，置于（25±1）℃条件下培养，光照度为2500 lx，光周期为12 h/12 h（光照/黑暗），接种30 d 后统计胚萌发率。

表3 胚胎萌发及幼苗生根培养基Table 3 The medium of embryonic germination and seedling rooting

1.2.3 不同胚拯救时期筛选 试验设置了5 个处理时期，即在授粉后30、32、34、36、38 d 时剪下幼果，放入筛选出的最佳培养基中进行胚胎拯救。具体操作为：在对应时间分别从每个杂交组合植株上取2 个青果，取出内部全部F1幼胚，消毒及培养条件同1.2.2，每个处理均接种3 瓶，每瓶2～9 个幼胚（视果实内幼胚多少而定）。培养30 d 后统计胚萌发率。

1.2.4 生根培养基筛选 试验共设10 个处理组合，以不加激素的SG0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂，pH 6.0）为对照，用萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸（IAA）3 种生长类激素各3 个浓度水平进行搭配（表3）。将拯救成功的高2～4 cm 的Ca4×Cc5 幼苗转接至SG 培养基中，培养条件同1.2.2。每个处理设置4 次重复，每次重复接种3 株幼苗，接种30 d 后统计生根茎段数、生根率、每茎段生根数及平均根长。

1.3 指标测定

1.3.1 坐果指标测定 授粉后记录各组合授粉总花数，于第14 天调查坐果情况，计算坐果率。

1.3.2 胚萌发指标测定 将幼胚接入培养基后，于第30 天观察幼胚的萌发情况，统计萌发幼胚数，幼胚萌发以长出子叶为标准。

1.3.3 根系各指标测定 将茎段接入不同的SG 培养基后，于第30 天对各处理的生根数、生根率、平均每茎段生根数、平均根长进行统计分析。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2016 进行数据处理和图表制作，采用DPS7.05 进行完全随机单因素试验方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同种间杂交组合的坐果率与种子数统计

由表4 可知，18 个正反交组合，共授粉花数1451 朵，平均坐果率总体较低，仅为7.58%，平均每果种子数为14.82 粒。但不同栽培种做母本时，坐果数（坐果率）存在差异。C.annuum做母本时共授粉899 朵花，坐果数为72 个，平均坐果率为8.01%，共获得种子1336 粒，平均每果种子数18.56 粒；C.chinense为母本时共授粉520 朵花，坐果数为28个，平均坐果率为5.38%，共获得种子223 粒，平均每果种子数7.96 粒；C.frutescens做母本时，共授粉32 朵花，坐果数为10 个，坐果率31.25%，获得种子数为71 粒，平均每果种子数7.10 粒。3 个栽培种分别做母本时，C.frutescens的坐果率最高，但其产生的种子数最少；C.annuum做母本时坐果率次之，其产生种子数最多；C.chinense做母本时，坐果率最低，所产生的种子数介于C.frutescens和C.annuum之间。

表4 正反交授粉及坐果统计Table 4 Pollination and fruit-setting of reciprocal interspecific

同时，不同的杂交组合，正反交坐果率也不同。杂交组合Ca1×Cc3、Ca2×Cc1 正交时均能产生杂交果实，坐果率分别为18.18%、14.29%，反交时无果实产生；Ca8×Cc6、Cc7×Cf1、Ca7×Cc4 正交时均无果实，反交则有果实，坐果率分别为32.50%、31.25%、11.54%。Ca6×Cc2、Ca4×Cc5、Ca3×Cc8、Ca5×Cc2 正反交时均有少数杂交果实产生，正交坐果率为3.13%～11.57%，反交坐果率为1.67%～5.00%。

2.2 胚胎拯救的萌发培养基筛选

将Ca4×Cc5 授粉后34 d 的幼胚分别接种于7种培养基上，结果如表5 所示，幼胚在MF0、MF1、MF2及MF4上萌发率相同，MF5次之，MF6的胚发育率较低，MF3胚萌发率为0，推测可能是激素浓度过高，抑制了胚的萌发。因此，从试验成本方面考虑，选择MF0作为最适合幼胚萌发的培养基，即不需要添加激素，胚胎拯救在MF0培养基上萌发情况见图2。

表5 培养基对辣椒幼胚胚胎拯救的影响Table 5 Effect of culture medium on embryo rescue of Capsicum

图2 不同发育时期的辣椒胚胎拯救Fig.2 Embryo germination and plantlet growth in different development stages

2.3 辣椒不同胚龄对胚胎拯救的影响

由于该部分试验对果实数量有要求，故选择了果实数量大于等于10（每个拯救时期需要2 个青果）的5 个杂交组合进行试验。由表6 可知，除Ca6×Cc2 组合外，其他4 个组合胚的萌发率在胚胎拯救期间随时间的延长均呈先上升后下降的趋势，34 d 的幼胚萌发率最高，为45.45%，38 d 有3 个杂交组合的幼胚萌发率为0，其原因可能为取材时间过晚，胚已死亡。在Ca1×Cc3、Ca6×Cc2、Cc6×Ca8、Ca4×Cc5 杂交组合中，34 d 胚龄的胚萌发率均最高，分别为31.58%、34.62%、45.45%、36.00%，仅在Cf1×Cc7 杂交组合中，34 d 胚龄的幼胚萌发率比32 d 胚龄低20.83%。可见，C.annuum或C.chinense做母本时，34 d 胚龄的幼胚最适合于拯救；而当C.frutescens做母本时，32 d 胚龄的幼胚最适合拯救。杂交组合Cf1×Cc7 整个幼胚拯救期间的胚平均萌发率最低，为11.43%，不同栽培种做母本时，其胚的萌发率有所不同。

表6 不同胚龄对辣椒胚胎拯救的影响Table 6 Effects of different embryo ages on embryo rescue of Capsicum

2.4 生根培养基筛选

由表7 可知，以SG0为基本培养基，添加3 个不同种类3 种不同浓度的生长类激素的培养基，其生根效果均存在差异。生根茎段数、生根率、平均每茎段生根数和平均根长均以SG3表现最优，平均每茎段生根数和平均根长显著高于其他处理。由图3可知，添加相同浓度不同种类的激素诱导的根形态也存在差异。添加0.5 mg·L-1NAA 的SG3表现为根多且粗壮，添加0.5 mg·L-1IBA 的SG6根较细且生根率低，添加0.5 mg·L-1IAA 的SG9表现为根少且长短不均，以MS 为培养基时，SG0表现为根少且细长。综上所述，添加0.5 mg·L-1NAA 的SG3培养基为辣椒组培苗生根最理想的培养基。

表7 不同浓度激素对辣椒组培苗生根影响Table 7 Effects of different concentrations of hormones on rooting of Capsicum tissue culture seedlings

3 讨论与结论

胚败育是辣椒种间杂交的一个共同特征[10]。在多数远缘杂交中，通常会收获到瘪的或退化的种子，这一现象被认为是受精后发育障碍导致的[11]。Martins 等[4]从C.annuum×C.baccatum组合中得到了9 粒种子，但有7 粒没有发育成完整植株；Yoon等[12]观察到C.annuum×C.baccatum杂交后胚败育发生在授粉后15 d，另一个现象是种子在成熟前便开始干燥失去活力。笔者试验中的18 对杂交组合，部分授粉后不能坐果，故无法对其进行胚胎拯救。另一部分授粉后可坐果，但因不同栽培种间亲缘关系较远，且存在杂交障碍，为防止果实内部幼胚在发育后期死亡而无法获得杂种植株，故选择在特定时间对其进行胚胎拯救。此外，笔者还观察到多数辣椒材料杂交后只有微小的种皮，部分种子中途褐化失去活力或没有种子，但果实仍能正常生长。Pickersgill[13]认为，受精后胚败育的合子障碍问题可以通过植物组织培养，特别是胚胎拯救技术来解决。

基因型不同，种间杂交、胚胎拯救技术难易程度不同。程志芳等[14]采用常规授粉技术对5 个辣椒栽培品种进行了种间正反交，仅从一小部分的辣椒杂交组合中获得了杂种植株。笔者的研究中总体种间杂交平均坐果率低，但不同栽培种做母本时仍有相对较大的差异。C.annuum为母本时，坐果率为0～18.18%，平均每果种子数为0～20.84 粒；C.chinense为母本时，坐果率为0～32.50%，平均每果种子数0～9.92 粒；C.frutescens为母本时，坐果率为31.25%，平均每果种子数7.10 粒。试验中正反交结实率差异较大，可见坐果率、果实内种子数与父母本的基因型有关。此外，笔者的试验在温度较高的温室内进行，推测高温可能会影响父本的花粉活力。

胚萌发是胚拯救的关键环节。培养基成分对幼胚萌发和存活有直接影响。据报道6-BA、NAA、GA3、ZT、IAA 对不同作物的幼胚萌发具有促进作用[15-18]，在辣椒胚胎拯救中常用的激素有IAA、GA3

[13，19]。但笔者研究发现不添加任何激素的MF0与添加IAA、6-BA 的处理无显著差异，推测该阶段导致幼胚败育的关键是营养亏缺，而不是激素水平的高低。

适宜的胚龄是胚胎拯救成功与否的最重要的影响因子之一。一般情况下，在杂种胚败育之前将胚取出进行离体培养可避免胚的早衰，而胚发育的越完全，拯救的成功率越高[20]。笔者的试验以30～38 d 胚龄的幼胚进行离体培养，其中C.annuum×C.chinense、C.chinense×C.annuum的杂交组合中34 d胚龄的胚萌发率最高，C.frutescens×C.chinense的杂交组合中32 d 的胚萌发率最高，而38 d 的胚萌发率普遍较低，主要表现为幼胚褐化，其主要原因推测为不同栽培种种间的杂交果实熟性有差异，导致酚类物质积累不同，故胚胎拯救效果不佳。因此，针对不同的辣椒栽培种，仍需要探究适合幼胚培养的最佳胚龄。

综上所述，试验中不同辣椒栽培种正反交组合坐果率整体较低但仍有差异。最佳胚萌发培养基选择低成本的MF0（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂，pH 6.0），胚平均萌发率可达到20%。胚拯救适宜的取材时期应在授粉后32～34 d，此时胚拯救成功率最高。生根培养基应选择SG3（MS+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂＋0.5 mg·L-1NAA，pH 6.0）。该体系适合本试验中3 个栽培种种间杂交幼胚的培养，研究结果为加快辣椒新品种选育进程奠定了基础。