复方降糖玉液调节JAK2/STAT3/SOCS-1通路对糖尿病肾损伤大鼠的保护作用研究

古丽努尔·艾尼,刘春丽,王彦娥

(新疆医科大学第一附属医院,新疆 乌鲁木齐 830054)

糖尿病肾损伤是糖尿病进展过程中常见的并发症,临床以肾小球滤过率降低及蛋白尿为主要特征,随着疾病进展会发展成为肾衰竭,危及患者生命。目前研究认为,糖尿病肾损伤的发生发展与糖代谢异常、肾脏血流动力学改变、肾组织氧化应激损伤、肾脏中异位脂肪沉积等多种因素有关[1-3]。酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信号传导及转录激活因子3(STAT3)/细胞因子信号抑制物1(SOCS-1)通路是近年来研究发现的与糖尿病肾损伤密切相关的信号通路[4],调节该通路及相关蛋白的异常表达能够显著修复糖尿病大鼠肾组织损伤[5]。复方降糖玉液是基于中医理论由多种中药材组成的中药成方制剂,临床用于糖尿病及其并发症的治疗疗效较好。本研究通过动物实验观察了复方降糖玉液对糖尿病肾损伤的修复作用及对JAK2/STAT3/SOCS-1通路的影响,旨在明确其药理作用,为其临床应用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性SD大鼠72只,6～8周龄,体重200～220 g,购自新疆医科大学实验动物中心,实验动物许可证号:SCXK(新)2018-0002。饲养环境温度22～25 ℃,相对湿度40%～70%,昼夜交替12 h,自由饮食。

1.2设备与仪器 CKX41-F32FL荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);SpectraMax iD5酶标仪(美谷分子仪器有限公司);S700石蜡切片机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);BK-280全自动生化分析仪(山东博科生物产业有限公司);STX622电子天平(奥豪斯国际贸易有限公司);Gel Doc EZ凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司);M16RS高速冷冻离心机(上海迈皋科学仪器有限公司)。

1.3药品及试剂 复方降糖玉液(新疆医科大学第一附属医院制剂,由黄芪15 g、生晒参10 g、制首乌10 g、黄精15 g、生地20 g、三七10 g、天花粉15 g组成,批号:11120021);厄贝沙坦(海正辉瑞制药有限公司,批号:CA161,规格:150 mg/片);高糖高脂饲料(北京博泰宏达生物技术有限公司,货号:1012);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司,货号:P4812);白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(上海酶研生物科技有限公司,货号:EK-R36877);单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)ELISA试剂盒(上海继和生物科技有限公司,货号:JH-H10542);JAK2(货号:ab108596)、p-JAK2(货号:ab32101)、STAT3(货号:ab68153)、p-STAT3(货号:ab267373)、SOCS-1(货号:ab280886)、GAPDH(货号:ab181602)兔单克隆抗体(艾博抗贸易有限公司),辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(艾博抗贸易有限公司,货号:ab150077);二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(货号:PC0020)、TUNEL试剂盒(货号:T2130)、HE染色试剂盒(货号:G1120)、磷酸盐缓冲液(货号:P1031)(北京索莱宝科技有限公司);蛋白酶K(碧云天生物科技有限公司,货号:ST533);含DAPI抗荧光淬灭封片液(碧云天生物科技有限公司,货号:P0131)。

1.4实验方法 随机取12只大鼠作为空白组,其余60只大鼠参考文献[6-7]方法建立糖尿病肾损伤模型:采用高糖高脂饲料喂养8周后,大鼠禁食12 h,一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,大鼠继续喂养7 d,采尾静脉血测定血糖(采血前大鼠禁食6 h),以血糖≥7 mmol/L视为糖尿病模型建立成功,继续喂养4周并收集24 h尿液,测定尿蛋白量,以空腹血糖≥16.7 mmol/L同时24 h尿蛋白量≥30 mg/24 h视为糖尿病肾损伤造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦及复方降糖玉液低、中、高剂量组,每组12只。复方降糖玉液低、中、高剂量组按照成人给药剂量的6.25倍计算,分别给予2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg(以生药含量计)复方降糖玉液灌胃,厄贝沙坦组参考文献[8-9]给予厄贝沙坦0.02 g/kg灌胃,空白组及模型组给予生理盐水灌胃,均 1次/d,连续8周。

1.5检测指标及方法

1.5.124 h尿蛋白定量及空腹血糖 末次灌胃后,收集各组大鼠24 h尿液,测定24 h尿蛋白定量。末次灌胃后24 h,禁食6 h,尾静脉取血,血糖仪测定空腹血糖水平。

1.5.2糖化血红蛋白及肾功能指标 大鼠称重后,采用10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉取血至干净离心管,全自动生化分析仪测定糖化血红蛋白、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平。

1.5.3肾指数及肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量 处死大鼠,取肾组织并称重,计算肾指数,肾指数=肾质量(mg)/体重(g)×100%。取肾组织,研磨匀浆后离心取上清,使用相应试剂盒测定TNF-α、IL-1β、MCP-1含量。

1.5.4肾组织病理形态 分离肾组织,制成5 μm石蜡切片,常规HE染色,置于显微镜下进行病理学观察。

1.5.5肾组织细胞凋亡情况 取制备好的5 μm石蜡切片,使用二甲苯脱蜡后,梯度乙醇至水,滴加20 μg/mL的蛋白酶K抗原修复后,磷酸盐缓冲液清洗3次,滴加50 μL的TUNEL染色液,37 ℃条件下避光孵育60 min,再次使用磷酸盐缓冲液清洗3次,滴加含有DAPI的抗荧光淬灭剂,盖上盖玻片,置于荧光显微镜下进行观察拍照。细胞凋亡率=TUNEL 阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5.6肾组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及SOCS-1蛋白表达情况 取肾组织,研磨匀浆后离心取上清,试剂盒测定蛋白含量并取含有50 μg蛋白的上清液,经电泳分离、转膜及脱脂牛奶封闭后,用GAPDH、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1兔抗体按照1∶1 000稀释后4 ℃孵育过夜,TBST清洗并用山羊抗兔二抗在室温下按照1∶2 000稀释后孵育1 h,使用化学发光液在凝胶成像系统拍照,以GAPDH为内参,Image J 1.8.0计算JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白相对表达量。

1.6统计学方法 所有数据使用SPSS 26.0软件进行分析处理,计量资料呈正态分布,结果以均数±标准差的形式表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较使用LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖及肾功能指标比较 模型组大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血红蛋白、BUN、SCr水平均明显高于空白组(P均<0.05);复方降糖玉液各组及厄贝沙坦组大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血红蛋白、BUN、SCr水平均明显低于模型组,且上述各指标均随复方降糖玉液剂量的增加而逐渐降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和糖尿病肾损伤各组大鼠血糖及肾功能指标比较

2.2各组大鼠肾指数及肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比较 模型组大鼠肾指数及肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明显高于空白组(P均<0.05);复方降糖玉液各组及厄贝沙坦组大鼠肾指数及肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明显低于模型组,且上述各指标均随复方降糖玉液剂量的增加而逐渐降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组和糖尿病肾损伤各组大鼠肾指数及肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比较

2.3各组大鼠肾组织病理学形态 空白组大鼠肾组织病理形态正常;模型组大鼠肾组织有明显炎症细胞浸润,细胞排列不整齐,肾小管扩张;与模型组比较,复方降糖玉液各组及厄贝沙坦组大鼠肾组织炎症浸润减轻,细胞排列整齐,肾小管无明显扩张。见图1。

图1 空白组和糖尿病肾损伤各组大鼠肾组织病理学HE染色表现(×200)

2.4各组大鼠肾组织细胞凋亡情况比较 空白组大鼠肾组织细胞无明显凋亡;模型组大鼠肾组织细胞出现大量凋亡,凋亡率明显高于空白组(P<0.05);复方降糖玉液各组及厄贝沙坦组大鼠肾组织细胞凋亡减少,细胞凋亡率均明显低于模型组,且细胞凋亡率随着复方降糖玉液剂量的增加而逐渐降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2及图3。

图2 空白组和糖尿病肾损伤各组大鼠肾组织细胞凋亡染色情况(×200)

图3 空白组和糖尿病肾损伤各组大鼠肾组织细胞凋亡率

2.5各组大鼠肾组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表达情况 与空白组比较,模型组大鼠肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明显升高(P均<0.05),肾组织中 SOCS-1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,复方降糖玉液各组及厄贝沙坦组大鼠肾组织中p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明显降低,肾组织中 SOCS-1蛋白相对表达量均明显升高,且上述各指标均随复方降糖玉液剂量的增加变化更明显,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图4。

图4 空白组和糖尿病肾损伤各组大鼠肾组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表达情况

3 讨 论

糖尿病肾损伤是由于糖尿病患者长期血糖控制不良引起的肾组织病变,目前以对症治疗为主,其中厄贝沙坦因具有降压、调节肾脏血流及保护肾细胞作用而被广泛用于高血压合并2型糖尿病肾损伤的治疗,所以本实验将其作为阳性对照药物。但现有的治疗手段均不能改变糖尿病肾损伤最终进展为终末期肾病的结局[10],所以研发糖尿病肾损伤的治疗药物尤为迫切。

中医理论认为,糖尿病肾损伤主要是由于脾肾亏虚,浊毒内蕴,进而导致肾络瘀结,肾用失司,肾阴亏虚,津液不足,脉络亏虚,涩滞成瘀,所以中医认为糖尿病肾损伤的治疗应以益气活血、扶正化瘀为主[11-12]。复方降糖玉液方中以黄芪、生晒参、制首乌补肝肾,益精血,起到补气固表之功效;以黄精补气养阴,健脾益肾;生地清热凉血、养阴生津;三七散瘀止血,消肿定痛;天花粉生津止渴;全方使阳升而阴应,进而起到益气补血、滋阴补肾之功效。本实验研究表明,复方降糖玉液各组及厄贝沙坦组大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血红蛋白、BUN、SCr、肾指数、肾组织细胞凋亡率均明显低于模型组,肾组织炎症浸润明显减轻,且各项指标随着复方降糖玉液剂量的增加变化更明显。提示复方降糖玉液可呈剂量依赖性地减轻蛋白尿,控制血糖水平,保护肾功能,减轻肾损伤,抑制肾组织细胞凋亡。

近年来研究表明,糖尿病肾损伤的发生及进展与JAK2/STAT3通路激活及炎症反应有关,TNF-α、IL-1β、MCP-1与肾组织的炎症反应有关,JAK2/STAT3/SOCS-1通路活化会导致TNF-α、IL-1β、MCP-1水平异常升高,进而导致大鼠肾组织炎症损伤的发生及进展[13];而下调肾组织中p-JAK2、p-STAT3表达,上调SOCS-1表达可减轻糖尿病肾损伤[13-15]。Porro等[16]研究证实,升高SOCS-1水平能够显著降低JAK/STAT通路相关蛋白水平,进而显著抑制炎症反应并促进抗炎因子的释放,进而抑制组织损伤。Morelli 等[17]研究表明,升高SOCS-1水平则能够通过抑制JAK/STAT通路的激活,进而有效降低IFN-γ及IL-22等炎症因子对组织器官的过度刺激作用,抑制炎症反应的发生。由此可见,调节JAK2/STAT3/SOCS-1通路及相关蛋白的表达水平可能是治疗糖尿病肾损伤的有效途径。本实验研究发现,模型组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明显升高,肾组织中 SOCS-1蛋白相对表达量明显降低;与模型组比较,复方降糖玉液各组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明显降低,肾组织中 SOCS-1蛋白相对表达量均明显升高。提示复方降糖玉液能够呈剂量依赖性地抑制JAK2/STAT3/SOCS-1通路激活,下调TNF-α、IL-1β、MCP-1水平,从而减轻肾组织炎症损伤,保护肾组织细胞。

综上所述,复方降糖玉液能够明显降低糖尿病肾损伤大鼠的尿蛋白和血糖,保护肾功能,抑制肾组织细胞凋亡,减轻肾组织损伤,其机制可能与调节JAK2/STAT3/SOCS-1通路,抑制TNF-α、IL-1β、MCP-1表达,减轻炎症反应有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。