猪流行性腹泻病毒检测方法的研究进展

2023-11-27吴纪芬山东省莒南县农业农村局

中国畜牧业 2023年20期

文│吴纪芬（山东省莒南县农业农村局）

近年来，猪流行性腹泻病毒对养猪业造成了严重影响。为了有效防控疫情，病毒检测方法取得了显著的进展。文章从流行病学、病毒基因组结构、病原学检测方法、分子生物学、免疫学和血清学等方面对猪流行性腹泻病毒检测方法进行概述。实时荧光定量P C R、R TLAMP等分子生物学方法具有高灵敏度和特异性，适用于病原核酸检测。免疫组织化学、胶体金免疫层析和ELISA等免疫学方法则用于检测病毒抗原或抗体，具有操作简便、快速等特点。血清中和试验作为一种评估抗体水平的方法，可评估动物的免疫状态。尽管各种检测方法都具有优缺点，但多种技术的结合与优化可为猪流行性腹泻病毒的准确检测和防控提供有力支持。

一、猪流行性腹泻病流行病学

猪流行性腹泻病最早于1971年在英格兰报道，于1978年首次分离得到病毒毒株，命名为CV777毒株。此后在德国、荷兰、法国、捷克、匈牙利等国家也相继报道有猪流行性腹泻病的发生。1982年，日本首次发现并报道该病，随后，韩国、印度等亚洲国家陆续发现并报告了该病。在中国，1973年首次报告了猪流行性腹泻病，而1982年成功分离出了病毒毒株。随后经过一系列的病原调查，于2010年，该疾病在我国大规模流行，新生仔猪死亡率高达50%～100%，并且出现毒力比CV777毒株毒力更强的毒株，导致我国养猪业损失惨重。对此要借助检测手段对该病进行检测，及早、及时检测，并通过有效的疫病防控手段加以防控，减少该病带来的损失。

二、猪流行性腹泻病毒基因组结构

猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）的α-冠状病毒属。PEDV的基因组是一个单链正链RNA，长度约为28000个核苷酸。病毒基因组具有典型的冠状病毒结构，包括以下几个主要基因：5'端的非结构蛋白基因（如ORF1a和ORF1b）、结构蛋白基因和3'端的非结构蛋白基因。其中结构蛋白基因包括：S（Spike）蛋白：S蛋白是病毒表面的突刺状结构，负责病毒的吸附和进入宿主细胞。S蛋白也是决定病毒毒力、抗原性和宿主范围的关键因素。E（Envelope）蛋白：E 蛋白是一个小型跨膜蛋白，参与病毒组装和释放过程。N（Nucleocapsid）蛋白：N蛋白与病毒RNA基因组结合，形成核衣壳结构，保护病毒基因组稳定性。M（Membrane）蛋白参与病毒的组装，同时可诱导宿主产生α干扰素和特异性抗体。对此M蛋白与N蛋白也可作为猪流行性腹泻病毒的分子生物学及血清学检测对象。而E蛋白因基因序列较小，被称为是小分子外膜蛋白。且E蛋白基因序列高度保守，由于基因序列过小难以进行研究，且难以得到精准的结果，因此，目前针对E蛋白有关的检测方法鲜有报道。

三、猪流行性腹泻病原学检测方法

1.病毒分离培养鉴定法。病毒的分离培养常作为病毒诊断技术的黄金标准，也是畜禽病毒传染病常用的检测手段，极少量的病毒也可以通过病毒的分离培养检测出来。该方法主要包括以下步骤。样品收集：收集疑似感染猪流行性腹泻病的仔猪粪便、肠内容或组织样品。病毒接种：将处理后的样品接种到敏感的细胞系上，如Vero细胞。在适宜的条件下（如37℃、5% CO2环境）进行培养，观察是否出现细胞病变。病变观察：在一定的时间内观察细胞的形态变化。若出现细胞病变现象，如细胞融合、变圆、脱落等，说明可能存在病毒感染。病毒鉴定：对病变细胞进行进一步检测，以确定病毒种类，可以通过实验室技术如间接免疫荧光（IFA）、聚合酶链反应（PCR）、ELISA等方法进行。病毒分离纯化：若实验结果表明存在猪流行性腹泻病毒，可以通过多次传代培养来纯化病毒株。病毒分离培养鉴定法是一种基本且常用的病原检测方法。但这种方法操作烦琐、耗时较长。因此，在实际应用中，研究者通常会结合其他快速、高效的检测方法进行病原学检测。

2.免疫电镜检查法。是一种将抗原-抗体反应与电子显微镜相结合的检测方法。在猪流行性腹泻病原学检测中，免疫电镜检查法可以直接观察病毒颗粒与特异性抗体的结合，从而实现对病毒的定性分析。这种方法具有较高的灵敏度和特异性。免疫电镜检查法步骤包括收集疑似感染猪流行性腹泻病的样品并处理、用化学固定剂固定样品、将固定样品制成适于电镜观察的超薄切片、用特异性抗体与金标记的二抗混合孵育切片、洗涤切片并染色及使用透射电子显微镜观察切片，判断病毒颗粒与金标记抗体复合物结合情况。

四、猪流行性腹泻病毒分子生物学检测技术

1.反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）。该技术应用于病毒特定RNA片段的体外扩增，结合了反转录（RNA转录为cDNA）和聚合酶链反应（cDNA的扩增），从而实现了对特定RNA序列的高效检测。该方法操作简单、特异性强、敏感性高，是检测核酸的最佳方法，也是实验室检测中常用的检测技术，该方法主要是通过对猪流行性腹泻病毒特定基因引物设计，建立检测猪流行性腹泻病毒的RT-PCR的方法，能够根据特异性引物扩增出来电泳后出现的条带大小，区分出不同的毒株。

2.荧光RT-PCR方法。荧光RTPCR技术是通过常规RT-PCR技术发展起来的核酸检测技术，其灵敏性更高、速度更快、特异性更好，可直接观察扩增结果，不需要后续电泳检测产物，减少了假阳性出现的风险，而常用的方法有染料法和探针法两种。通过设计病毒的一对特异性引物，建立荧光PCR检测方法，可以特异性地检测猪流行性腹泻病毒；其次还可以建立多重实时荧光定量PCR方法，可以使用该方法对不同病毒进行同时检测，该方法特异性好，不会出现交叉反应。

3 . 环介导等温扩增技术（LAMP）。该技术具有高效、快速、特异性强等优势，该技术在恒温条件下进行无需热循环仪，因此具有较高的实用性。主要包括以下步骤：设计特异性引物：为猪流行性腹泻病毒的特定基因区域设计一组特异性引物，通常包括两个内部引物和两个外部引物。反转录：通过反转录酶将病毒的RNA转换为cDNA。环介导等温扩增：在单一恒温条件下利用特异性引物和DNA聚合酶对cDNA进行扩增。扩增过程中，引物和模板DNA之间形成环状结构，从而实现快速、高效的扩增。检测扩增产物：扩增完成后，可以通过凝胶电泳、荧光染料结合或其他方法检测扩增产物，从而判断样品中是否含有猪流行性腹泻病毒。

4.基因芯片技术。该技术是一种高通量、高灵敏度的检测方法，适用于对多种病毒和基因同时进行检测和分析。芯片技术具有高灵敏度，最低检测限为106拷贝/微升，特异性也很高，不存在交叉反应。制备好的芯片在4℃条件下至少可以保存2个月。

五、猪流行性腹泻病免疫学检测方法

1.免疫荧光法（IF）。免疫荧光法（IF）是一种利用荧光标记的抗体检测病毒抗原的方法。免疫荧光法用于猪流行性腹泻病毒检测，步骤如下：制备感染猪薄片或细胞涂片；用化学固定剂和渗透剂处理样品；用荧光素标记抗体孵育样品；洗去未结合抗体；用荧光显微镜观察荧光信号。此方法灵敏、特异，可快速检测病毒抗原，助力疫情防控。

2.免疫组织化学（IHC）。免疫组织化学检测猪流行性腹泻病毒步骤：制备组织切片、抗原修复、阻断非特异结合、抗体孵育、二抗孵育、洗涤、染色、显微镜观察。此方法灵敏度高、特异性强，能准确快速检测病毒抗原，助力疫情防控。

3.胶体金免疫层析技术。胶体金免疫层析技术是一种简便、快速的猪流行性腹泻病毒检测方法。主要步骤包括制备胶体金-抗体复合物，制作试纸，处理样品，进行试纸浸润，判定结果。此技术操作简单、速度快、成本低，适用于现场筛查。但灵敏度和特异性相对较低，阳性结果需进一步实验室检测确认。

六、猪流行性腹泻病血清学检测技术

1.酶联免疫吸附试验（ELISA）。该方法是一种血清学检测方法，适用于猪流行性腹泻病毒抗体检测。其操作步骤包括血清样本收集，抗原制备与吸附，阻断非特异性结合，样品孵育、洗涤、二抗孵育、再次洗涤、底物显色、终止反应和光密度测定。ELISA具有较高的灵敏度和特异性，可为疫情防控和免疫评估提供准确、快速的检测结果。

2.血清中和试验。血清中和试验（SNT）用于检测猪流行性腹泻病毒特异性中和抗体。步骤包括采集血清，稀释，制备病毒，孵育混合物，接种细胞，观察病变，计算滴度。SNT具有高灵敏度和特异性，但操作烦琐、耗时长且需细胞培养条件。