寡糖糖脂巯基双十六烷基醚聚乙二醇寡糖双亲性物合成方法研究

郑海富，夏勋荣，顾佳雨，李明明，夏 炎

（1.江苏省计量科学研究院（江苏省能源计量数据中心）苏州实验室，苏州 215121；2.江苏省计量科学研究院（江苏省能源计量数据中心）电离辐射与医学工程计量研究所，南京 210023）

糖类化合物经常以共价键的方式与不同种类的非糖天然产物缀合在一起，其中糖基部分在分子中起着生物信息储存、转运等作用，同时影响分子的溶解性、选择性和生物活性[1-3]，最重要的一类就是糖和脂类相连形成的糖脂化合物。糖脂的发现促进了自组装单层膜（SAM）模拟细胞表面蛋白特异性识别研究。SAM 是将合适基底放入到待组装分子的溶液或气氛中后，分子自发地通过化学键牢固地吸附在固体表面而形成的一种有序组合体，广泛应用于巯基在硅基底的结合固定，其高稳定性的自组装能力和优异的抑制非特异性识别缔合性能使其在医药卫生等领域具有重要的应用前景[4-7]。蛋白与糖的特异性识别作用在细胞黏附、转运、新陈代谢和免疫应答等许多细胞的生命过程中起到重要作用，这些特异性识别作用是通过细胞表面的糖脂、糖蛋白和多聚糖物质与凝集素蛋白的相互作用完成。

研究表明，适宜长度寡聚乙二醇（OEG）比长链更能有效阻抗蛋白对表面的非特异性吸附[8-9]。用含有PEG 的分子自组装膜来阻抗蛋白非特异性吸附，推测了PEG 阻抗蛋白吸附的机理：当蛋白接近PEG 修饰的表面时，结合在PEG 链周围的水分子被挤压了出来，增加了PEG 分子链之间的空间排斥力，这样有助于覆盖有PEG 的表面阻抗蛋白的非特异性吸附[10]。现在一般趋于认为，PEG 抗蛋白非特异性吸附是由于其周围紧密结合的水层阻止蛋白质与表面的直接接触面[11]，具有较强水合能力的聚乙二醇链，可防止可溶的生物分子例如蛋白质的非特异性吸附。另一方面，化学改性的聚乙二醇不可促进仿生膜流动。显然，有OEG 连接的功能配体之间，不仅可以提高配体和蛋白质之间的流动性，增加头基与蛋白质的接触面，并且能够诱导头基与蛋白质在多个作用部位之间发生特异性识别结合。

据此，本文设计合成单巯基双十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂，该糖脂化合物以α-甘露糖作为糖脂头基，OEG 作为间链，一条饱和十六烷基醚作为疏水尾链、带有巯基的另一条尾链最为亲水亲油平衡固定链。该糖脂化合物具有活性好，常温下结构稳定，立体选择性好，平衡固定链末端的巯基能够自发结合在金等基底，可形成稳定的SAM，在SAM 研究领域具有广泛的应用场景，并具有抗非特异性吸附等诸多优点[12-15]。其化学结构如图1 所示。

图1 单巯基双十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂结构式

1 实验方法

1.1 仪器设备

核磁共振波谱仪（AV-500/300，Bruke）；TOF-MS 仪（LCTIM，Micromass）；集热式恒温加热搅拌器（DF-101S，南京文尔仪器设备有限公司）；旋转蒸发仪（R210D，杭州大卫科教仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9053A，上海精宏实验设备有限公司）；等等。

1.2 试剂

三乙二醇、烯丙基溴、乙醚，乙酸乙酯；二氯甲烷；四氢呋喃（THF）、无水硫酸镁等试剂为分析纯，购自中国国药集团；三甲硅基三氟甲磺酸脂（TMSOTf）、乙醇胺、无水硫酸钠、间氯过氧苯甲酸（MCPBA）、三氟化硼合乙醚（BF3·C2H6O）和苄基三乙基氯化铵（TEBA）等试剂为化学纯，购自日本百灵威试剂有限公司；等等。整个实验过程所需超纯水通过UPH-IV 超纯水系统制备。

1.3 单巯基双十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂合成

1.3.1 烯丙氧基三甘醇的合成（TG-Ally）

10 mL 三甘醇溶解在30 mL 干燥的THF 中，室温下搅拌30 min 后加入3.5 g 纯钠快速搅拌1 h，滴加15 mL 烯丙基溴，继续反应6 h。减压蒸馏后的残留物用30 mL 二氯甲烷溶解，用饱和NaCl 溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩后柱层析提纯得到无色油状产物4 g，产率80%。柱层析∶硅胶：Et2O/EtOAc，1∶1。

1.3.2 烯丙氧基三甘醇酰基甘露糖合成

中间体2，3，4，6-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖三氯乙酰亚胺酯依据本文作者为第一发明人的授权专利“一种2，3，4，6-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖三氯乙酰亚胺酯的合成方法（ZL201510669042.9）”制备获得。

0.5 g 2，3，4，6-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖三氯乙酰亚胺酯和1.25 g TG-Allyl 混合后溶解在10 mL 干燥的THF 中，室温搅拌30 min，快速滴加125 μL TMSOTf，连续搅拌30 h 后，加入125 μL 乙醇胺分解多余TMSOT，用饱和NaCl 溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤浓缩柱层析得到无色黏稠状产物0.4 g，产率为75%。柱层析∶硅胶：EtOAc/Petroleum（v/v=1∶1）。

1.3.3 氧丙基三甘醇酰基甘露糖合成

5 g 的烯丙氧基衍生物与10 g MCPBA 混合后溶于30 mL 的二氯甲烷中，缓慢加热至50 ℃，维持该温度搅拌反应24 h。利用冰水混合物冷却至0 ℃后过滤，将浓缩后的滤液与20 mL 蒸馏水混合，利用乙醚/乙酸乙酯混合溶剂（v/v=1∶2）萃取。含水相通过减压蒸馏获得透明固体产物3g，产率为80%。

1.3.4 单十六烷基醚三甘醇酰基甘露糖合成

3 g 环氧丙基三甘醇酰基甘露糖与5 g 十六烷基醇依次溶解在20 mL 无水二氯甲烷中，60℃下搅拌2 h后，在氮气氛围下缓慢滴加3 mL BF3·C2H6O，持续搅拌12 h，反应物用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相减压浓缩后在真空箱内干燥一整夜，得到无色蜡状固体产物2 g。产率为70%。

1.3.5 三苯基硫双十六烷基醚三甘醇酰基甘露糖合成（AcM-TG-Allyl）

2 g 单十六烷基醚三甘醇酰基甘露糖固体溶解在300 mL 无水DMF 中，加入7 g 三苯基十七烷基甲磺酸盐，室温下搅拌20 min，加入2.6 g 氢化钠及0.5 g 的TABI，室温下反应36 h。反应物用50 mL 的二氯甲烷稀释，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥有机相经过过滤、浓缩后经柱层析分离得到白色固体2.3 g，产率为70%。柱层析∶硅胶：EtOAc/Petroleum（v/v=2∶1），Rf=0.43。

1.3.6 三苯基硫双十六烷基醚三甘醇四羟基甘露糖合成

2 g AcM-TG-Allyl 溶解在34 mL 无水甲醇中，加入1 g 钠室温搅拌20 h，加入3.3 mL 醋酸中和，浓缩后柱层析得到白色固体0.5 g，产率为89%。柱层析∶硅胶：CH2Cl2/MeOH（v/v=5∶1）。

1.3.7 单巯基基双十六烷基醚三甘醇四羟基甘露糖合成

1 g 该化合物溶解在15 mL 三氯甲烷和4 mL THF的混合溶液中，通过恒压漏斗滴加4 mL THF，室温搅拌0.5 h，加入0.1 g 的TEBA，40 ℃持续搅拌15 h。反应液饱和NaCl 水洗涤后，有机相减压蒸馏浓缩通过柱层析得到无色透明黏稠液体，放置冷冻室内3 h，得到白色蜡状固体产品0.6 g，产率为65%。柱层析∶硅胶：EtOAc/CH3OH（v/v=8∶1），Rf=0.43。

2 结论

本文针对寡糖糖脂化合物在化学法合成过程中涉及众多羟基、醚键、巯基活性、催化剂选择及极低产率等系列等问题，通过改善和提高两亲性含巯基寡糖糖脂的合成步骤和产率，创新了单巯基双十六烷基醚聚乙二醇间链寡糖糖脂的合成方法，解决糖基供体卤代糖的稳定性差，不易保存、不易获得具有潜在药用价值糖苷化试剂的问题。合成的新型单巯基双十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂具有活性好，常温下结构稳定，立体选择性好，形成的SAM 膜稳定等诸多优点，相应的合成方法也可用于合成系列单双巯基、可变烷基链级聚乙二醇间链等寡糖和多糖，在糖缀化合物合成研究领域有重要的作用。

致谢

本论文的前期实验数据整理、调研、撰写及后期的修改除文中所列作者的贡献外，还得到了南京工大膜设计研究院有限公司杨梅高级工程师的大力协助，在此一并表示感谢。同时，该调研工作得到了江苏省市场监管局科研项目《基于肿瘤细胞表面糖簇特异性识别的蛋白纳米门控释药竞争性靶向精准治疗体系构筑及性能研究》资金支持（项目编号：J2022011）。