短链脂肪酸气相色谱-质谱测定方法的建立

卜子晨，郑诗琪，王 佳，夏永军，艾连中，王光强

（上海理工大学健康科学与工程学院 上海食品微生物工程技术研究中心 上海 200093）

短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物的重要代谢产物。它们主要由厌氧微生物的多糖、寡糖、蛋白质、多肽和糖蛋白前体形成[1]。短链脂肪酸是饱和脂肪酸的一个子集，含有6 个或更少的碳分子，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸[2]。在人体中，乙酸、丙酸和丁酸是肠道发酵产生的3 种主要短链脂肪酸，占肠道短链脂肪酸含量的95%，宿主产生短链脂肪酸的主要部位是结肠和盲肠[3]。其中SCFAs 的浓度在近端结肠较高，在远端结肠较低。SCFAs 参与人体代谢，在肝脏、骨骼肌、脂肪组织和胰岛等不同器官中具有重要功能，可以直接影响碳水化合物代谢和脂质利用，并通过副交感神经系统间接调节能量代谢[4]。SCFAs 被报道可以缓解肥胖、糖尿病，抑制炎症和肿瘤细胞生长[5-7]。近年SCFAs 的测量已被用于研究许多疾病。粪便标本是研究SCFAs 浓度与疾病之间相关性的最常用标本，它能够反映结肠中SCFAs 的产生与吸收之间的平衡[8]。为了分析饮食、肠道微生物群和宿主健康之间的关系，需要可靠、方便、灵敏的方法来准确测定短链脂肪酸的含量。

生物样品中SCFAs 的分析方法多种多样，其中包括高效液相色谱（HPLC）联合紫外检测[9]、固相微萃取气相色谱-质谱联用技术（SPME-GCMS）[10]、核磁共振（NMR）[11]、毛细管电泳（CE）[12]等。由于SCFAs 具有较强的挥发性，在所有用于测定短链脂肪酸的设备中，气相色谱是最广泛用于短链脂肪酸分析的设备，并且与质谱联用具有更好的灵敏度和选择性[13]。然而，直接进样分析回收率较低，并存在杂质污染气相色谱柱的现象[14]。由于丙酸峰面积比较小，因此直接进样也很难使其明显出峰。为了提高检测灵敏度和对柱子较少的损害，衍生化方法是更好的选择。由于挥发性酸物质较难检测，且峰很难分离，因此硅烷化方法是气相色谱分离挥发性酸的一种常用方法。硅烷化试剂有很多种，其中N，O-双（三甲基硅基）乙酰胺（BSA）、N，O-双（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（BSTFA）和N-甲基-N-（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（MSTFA）是GC/MS 分析中最常用的试剂[15]。这些衍生化剂通过三甲基硅基取代酸、醇、硫醇、胺、酰胺、酮和醛中的活性氢，与生物有机分子具有良好而广泛的反应活性[16]。相比较而言，很少用BSA 来检测挥发性较强或分子质量很低的化合物，而BSTFA 虽与BSA 相似，但由它生成的副产物挥发性优于BSA，且更容易与衍生物分离，从而达到更好的出峰效果。常规的硅烷化试剂在检测器中能形成SiO2，污染指数高并且会增加基线的噪音，BSTFA 分子中含有3 个氟原子，在检测过程中可使SiO2进一步转化为SiF4，从而有效降低污染情况[17]。与MSTFA 相比，BSTFA 氯甲酸盐运行时间更短，受空间位阻的影响更小，丁酸的分离效果更好，且操作时间较短，具有更好的衍生化效率和灵敏度[18]。最终选用GC-MS 联合BSTFA 衍生化试剂，旨在建立一种可以高效定量分析短链脂肪酸的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养环境

SPF 级雌性C57BL/6 小鼠，购于南京模式动物有限公司。小鼠饲养环境条件为温度（23±2）℃、相对湿度控制在（50±5）%、12 h 光照和12 h 黑夜的环境中，自由取食、进水，适应1 周后进行实验。

1.2 材料与试剂

乙酸、丙酸、丁酸（纯度≥99%）购自源叶生物；无水乙醚，盐酸，均为分析级，购自国药集团化学试剂有限公司；N，O-三甲硅烷基三氟乙酰胺（BSTFA），无水Na2SO4，购自Sigma 公司。

1.3 主要仪器设备

Thermo 气相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；漩涡振荡仪；3-18K 型离心机，德国Sigma 公司；PL2002 型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；GT200 研磨仪，北京格瑞德曼仪器设备有限公司。

1.4 气相色谱条件

色谱柱：TG-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。初始温度40 ℃，保持2 min，以15 ℃/min 升至150 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min。进样口温度：260 ℃；载气：氮气（纯度≥99.999%）；分流比：10∶1；柱流速：1 mL/min；进样量：1 μL；溶剂延迟时间：3 min。

1.5 质谱条件

离子源：EI 源（70 eV）；离子源温度：230 ℃。定性时扫描方式为全扫描（m/z 40～400），采集频率为每秒12.8 次，定量时扫描方式为选择性离子扫描，乙酸、丙酸、丁酸扫描离子为（m/z）：117，131，145。采用外标法计算短链脂肪酸的含量。

1.6 试验方法

1.6.1 样品前处理 小鼠排便后立即用镊子收集粪便样本0.05 g 左右并与500 μL 纯水混合，用研磨仪快速研磨至形成匀浆状态，然后低速振荡30 min。随后放入冷冻离心机13 000 r/min 的条件下离心30 min。将100 μL 的上清液转移到离心管中，并加入10 μL 5 mol/L HCl 使粪便溶液pH 值在2 左右。酸化后的粪便匀浆加入100 μL 无水乙醚，漩涡振荡混匀，10 000 r/min 的条件下离心5 min。取上清转移至含无水Na2SO4的离心管中，从而去除多余水分。重复萃取2 次。

衍生化过程：将100 μL 无水乙醚层转移至内插管中，加入5 μL 的BSTFA，漩涡振荡后保存在气相小瓶中。70 ℃孵育20 min，37 ℃孵育2 h。最后将样品上机处理。

1.6.2 回收率和精密度 将小鼠粪便样品加入3种不同水平（10，50 和250 μmol/L）的混合SCFAs标准品，按上述方法衍生化并进行GC-MS 分析，计数出回收率。并采用相同浓度的粪便SCFAs 提取物测定精密度。

1.6.3 小鼠粪便、盲肠、结肠中SCFAs 的含量比较 小鼠适应性饲养1 周，收取0.05 g 左右粪便。脱颈椎处死后，分别取0.05 g 左右盲肠和结肠内容物。并为加入无菌水按上述衍生化方法处理。随后对3 种SCFAs 进行含量测定和比例分布统计。

1.6.4 数据统计分析 本试验中得到的结果进行统计分析，利用Origin 9.0 软件处理数据并作图，采用SPSS 22.0 数据分析软件进行显著性差异分析。所有数据均用“平均值±标准差”（mean±SD）表示。P>0.05 无显著性差异，P<0.05 有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 线性关系

将3 种短链脂肪酸进样后获得各自的出峰时间，它们的出峰顺序为乙酸、丙酸和丁酸。色谱图见图1，3 种SCFAs 的色谱峰得到很好的分离。根据峰面积，绘制出标准曲线，并以峰面积对不同浓度进行线性回归，结果见表1。根据线性回归方程和R2可知乙酸、丙酸、丁酸在25～400 μmol/L 范围内线性关系良好。

表1 不同SCFAs 线性关系考察Table 1 The linear relationship of different SCFAs

图1 混合SCFAs 的GC-MS 色谱图Fig.1 The chromatogram of mixed SCFAs

2.2 精密度

粪便样品中SCFAs 分析方法精密度分析结果见表2。对同一粪便样品进行5 次平行进样测定，试验结果显示，峰面积和保留时间的RSD 均小于4%，表明仪器的精密度良好。

表2 精密度测定结果Table 2 The precision of the method for the determination of mixed SCFAs

2.3 回收率

粪便样品 GC-MS 回收率分析结果见表3。对粪便样品进行回收率试验，按照上述色谱条件进行测试，结果显示，加样回收率达到了86%～96%之间，各组分加样回收率的RSD 均小于4%，说明本试验的分析条件下测定短链脂肪酸的方法可靠。

表3 添加不同含量SCFAs 的粪便样本回收率测定结果Table 3 Determination results of fecal sample recovery with different SCFAs content

2.4 小鼠粪便、盲肠、结肠中SCFAs 的含量

体内的肠道菌群通过发酵难以消化的碳水化合物来产生SCFAs，它们会显著参与多种代谢功能，并且对机体系统产生有益的影响。SCFAs 不但可以调节肝脏中的脂肪生成和胆固醇生物合成等机制，并通过刺激肠道内分泌细胞调节能量稳态[19]。因此本试验通过对小鼠粪便的衍生化处理，来确定小鼠中SCFAs 的含量，结果发现通过该GC-MS 方法均能检测到乙酸、丙酸和丁酸的含量。由图2a 的比例分布图所示粪便中含量最多的就是乙酸，高达73.9%，其次是丙酸（17.6%）和丁酸（8.5%）。这样的含量分布顺序与之前报道的文献基本吻合[20-21]。由图2b 可知，SCFAs 在粪便、盲肠和结肠中均有分布。其中盲肠中SCFAs 最高，粪便次之，结肠中最少。且盲肠中的乙酸、丙酸、丁酸含量均与结肠有显著性差异（P<0.05）。

图2 SCFAs 占比和不同部位SCFAs 的含量Fig.2 Proportion of SCFAs and content of SCFAs in different parts

3 结论

本试验中采用BSTFA 作为硅烷化试剂，可以有效解决SCFAs 分离效果差，挥发性太高从而不出峰等问题。利用无水乙醚作为广泛提取SCFAs的常用试剂，结合无水硫酸钠的使用可以更有效的把多余的水分去除，使得结果更准确，而且对机器的损伤也降到最低。从而建立了一种线性关系良好，回收率高，精密度达标的检测SCFAs 的方法。并且该方法可以准确的测出粪便中乙酸、丙酸和丁酸这3 种最常见的SCFAs，没有明显的杂峰和干扰峰。并通过试验检测出小鼠肠道内盲肠中SCFAs 含量最多，并且乙酸、丙酸和丁酸的分布情况是：乙酸＞丙酸＞丁酸。