类风湿关节炎患者血清外泌体长链非编码RNA Hotair和XIST的表达及意义*

于娟,孙宁,宋淑圣,张力,张健,李晓军(.南京市溧水区人民医院检验科,南京 00;.东部战区总医院基础医学实验室,南京 000)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性全身性系统性自身免疫病,典型的病理特征是滑膜炎和血管炎,主要临床表现是远端关节对称性畸形和功能丧失。全世界约1%的人口受RA影响,欧洲人和亚洲人的患病率较高,确切致病机制仍未完全阐明,遗传和环境因素具有重要作用,炎症反应和免疫紊乱是关键因素[1-2]。

目前,RA诊断主要依靠临床表现、实验室检查和影像学检查,实验室诊断标志物主要包括红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reaction protein,CRP)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP)。外泌体(exosome)直径30～200 nm,属于细胞外囊泡的一种,所有类型细胞均可分泌,存在于人体各种体液中,包括血清、唾液、脑脊液和尿液等。外泌体由磷脂双分子层包裹,结构稳定,可抵抗外环境各种酶的消化,内含大量生物活性物质如蛋白质、脂类和核酸,可近距离或远距离在相同或不同类型细胞间互相传递生物活性物质进行细胞间通讯[3-4]。外泌体受到广泛关注,其所含微小核糖核酸(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)成为研究热点。大量研究表明,外泌体中的miRNA可能作为RA诊断的潜在标志物,如miR-1915-3P、miR-187-5p等[4-6]。LncRNA是一种新发现的长度超过200个核苷酸的非编码RNA,在不同细胞、组织、体液以及不同疾病中均具有各自特异性表达谱,主要通过影响免疫细胞的功能,发挥抑炎和促炎的双重作用[7-8]。目前外泌体中的lncRNA在RA诊断的研究报道较少。本课题组采用基因芯片技术对RA患者血清和滑膜细胞进行lncRNA差异表达及生物信息学分析,筛选出4种差异表达的lncRNAHotair、XIST、H19和MALAT1[9-11]。本研究将探讨血清外泌体携带的4种lncRNA可否作为RA诊断的潜在生物学标志物。

1 资料和方法

1.1研究对象 选择2017年1月至2018年12月在东部战区总医院门诊治疗的70例RA患者,年龄31～62岁,平均年龄48.6岁,男性29例,女性41例;40例SLE患者,年龄23～65岁,平均年龄45.6岁,男性16例,女性24例。纳入标准:RA患者均符合2010年美国风湿病学学会(ACR)和欧洲抗风湿联盟(EULAR)提出的诊断标准[12],SLE患者符合ACR 2009年修订的分类标准[13]。排除标准:患有传染性疾病如结核、艾滋病等;患有恶性肿瘤及其他自身免疫病;患有血液系统疾病;近期使用糖皮质激素及其他免疫抑制剂药物治疗者。选择同期40例健康体检者作为健康对照组,30～64岁,平均年龄47.4岁,男性16例,女24例。3组年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得东部战区总医院伦理委员会批准(批准文号:2016NZGKJ-049)。

1.2主要仪器与试剂 7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司),IMMAGE 800比浊分析仪(美国Beckman-Coulter公司),i2000型化学发光仪(美国Abbott公司),分光光度计(德国Eppendorf公司)。ExoQuick血清外泌体提取试剂盒(美国System Biosciences公司),DP315-R型RNA提取试剂盒(北京天根生物公司),SYBR®Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒(上海TaKaRa公司),引物由南京锐真生物公司合成,CRP、RF检测试剂盒(美国Beckman-Coulter公司),anti-CCP检测试剂盒(美国Abbott公司)。

1.3标本采集与处理 用含促凝剂的真空采血管采集患者空腹静脉血5 mL,室温静置30 min,3 000 r/min离心10 min。收集血清至无酶EP管中,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,去除细胞及碎片后-80 ℃冰箱保存,用于后续外泌体提取。

1.4方法

1.4.1血清外泌体分离 将收集到的血清样品从-80 ℃冰箱取出复温20～30 min,4 ℃、3 000 r/min离心15 min,去除细胞碎片及杂质。每个样本吸出250 μL血清至新的EP管中,加入63 μL ExoQuick溶液震荡混匀15 s。混合物4 ℃温育30 min,4 ℃、12 000 r/min离心30 min,弃上清液,加入100 μL PBS至含有外泌体的沉淀物中,充分搅拌吹打混匀,用于下一步实验使用。

1.4.2透射电子显微镜(TEM) 取按照1.4.1提取的外泌体溶液20 μL与20 μL PBS混匀,取20 μL滴在一干净的200目载样铜网上室温2 min晾干,再滴20 μL 2%磷钨酸溶液复染1 min,用干净的滤纸轻轻吸去多余的液体晾干2 min。在南京大学公共实验平台使用JEM-200CX透射电子显微镜(日本JEOL公司)拍摄外泌体图片。

1.4.3纳米粒径追踪仪检测血清外泌体浓度 500 μL血清样本按照1.4.1的方法预处理,吸取126 μL ExoQuick溶液用于提取外泌体,沉淀物悬浮于125 μL PBS中备用。Zeta View纳米颗粒跟踪分析仪(德国Particle Metrix公司)用于检测外泌体的粒径和浓度分析。

1.4.4RNA提取与实时定量PCR(RT-qPCR) 采用1.4.1方法提取血清外泌体,使用RNA提取试剂盒提取总RNA,操作过程参照试剂盒说明书,提取的总RNA溶解在60 μL DEPC水中,纯度和浓度使用分光光度计进行测量。提取的总RNA经过RT-PCR逆转录为cDNA,反应体系为10 μL:2 μL 5×Prime Script Buffer,4 μL RNA模板,4 μL DEPC水;反应条件为:37 ℃ 5 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min。GAPDH为内参基因,RT-qPCR测定lncRNAHotair、XIST、H19、MALAT1的表达量。RT-qPCR反应体系为20 μL:2 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ,上、下游引物(浓度为10 μmol/L)各1 μL,12 μL DEPC水, 4 μL cDNA模板;反应条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,循环40次。基因表达的差异是通过2-ΔΔCt计算,其中ΔCt实验组=Ct(目的lncRNA)-Ct(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt实验组-平均ΔCt健康对照组。引物序列如下表1。

表1 扩增GAPDH、Hotair、XIST、H19及MALAT1所用引物序列

2 结果

2.1血清外泌体形态检测和纳米粒径分析 HC组、RA组和SLE组血清分离得到的外泌体分别经TEM成像显示,外泌体形态结构完整,大小不一,为双层膜结构包裹的椭圆形或类似圆形的纳米颗粒,直径约30～200 nm(图1)。纳米粒径分析仪可以直观看到做布朗运动的纳米颗粒,结果显示HC组平均粒径为124.92 nm,RA组平均粒径126.78 nm,SLE组平均粒径125.7 nm,3组样本的粒径检测粒径范围均在30～200 nm。

图1 外泌体TEM结果

2.2血清外泌体浓度检测 分别随机选择HC组、RA组和SLE组各15例患者,3组年龄和性别分布无显著差异(P<0.05)。每个患者血清样本取1 mL,每组分别5个样本进行混合,然后从混合血清中分离外泌体,使用纳米粒径追踪分析仪分别进行浓度检测。HC组患者外泌体浓度为(3.40±0.28)×1012/mL,RA组患者外泌体浓度为(6.50±0.79)×1012/mL,SLE组患者外泌体浓度为(5.30±0.90)×1012/mL,结果显示,RA组患者血清外泌体浓度水平显著高于HC组(t=5.24,P<0.05),SLE组患者血清外泌体浓度水平显著高于HC组(t=2.85,P<0.05),RA组与SLE患者之间血清外泌体浓度水平无显著差异(t=1.42,P>0.05)。

2.3Hotair和XIST在RA患者中高表达 采用RT-qPCR方法检测3组患者血清外泌体中lncRNAH19、MALAT1、Hotair和Xist的表达水平,lncRNAH19和MALAT1在3组中表达量低,且差异无统计学意义(P>0.05);LncRNAHotair和XIST表达水平在RA组中显著高于SLE和HC组(P<0.001),见表2。

表2 血清外泌体中lncRNA H19、MALAT1、Hotair和Xist的相对表达水平

2.4ROC曲线分析Hotair和XIST在RA患者中的诊断价值 以HC组和SLE组作为对照组,评价2种lncRNAs对RA的诊断价值。如图2所示,Hotair的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.84(95%CI=0.78～0.90,P<0.001),cut-off值为1.31时,敏感性为91.43%,特异性为61.25%,阳性预测值为68.82%,阴性预测值为89.47%;XIST的AUCROC为0.76(95%CI=0.68～0.83,P<0.001),cut-off值为1.65时,敏感性为65.71%,特异性为75%,阳性预测值为70.59%,阴性预测值为73.17%。

图2 ROC曲线分析血清外泌体来源LncRNA Hotair、XIST在RA中的诊断价值

2.5Hotair和XIST的表达水平与RA患者anti-CCP、RF、ESR、CRP和DAS-28评分的关系Hotair和Xist的表达水平与ESR呈正相关,r值分别为0.646和0.640;与CRP呈正相关,r值分别为0.780和0.747;与DAS-28评分呈显著正相关,r值分别为0.516和0.544。然而,2种lncRNA均与抗CCP或RF无显著相关或弱相关关系。见表3。ESR、CRP水平和DAS-28评分是疾病活动的指标,因此,LncRNAHotair和Xist可能作为RA患者疾病活动的重要分子标志物。

表3 RA患者血清外泌体Hotair、XIST表达水平与实验室相关指标及DAS-28评分的相关性分析

3 讨论

人类基因组中,非编码RNA约占据细胞总RNA的99%,lncRNA作为一种非编码RNA,在自身免疫病中参与炎症、异常增殖、迁移、侵袭和凋亡的过程,促进炎症因子释放,加重或减轻疾病的严重程度[8,15]。外泌体结构稳定,其所含lncRNA在多种疾病中得到鉴定,可作为预测癌症、心血管疾病和自身免疫病等发生和发展的生物标志物[15-17]。

SLE和RA是常见的多系统自身免疫病,临床表现、血清学特征、免疫学特征和转录组常具有一些相似性导致鉴别诊断存在困难[18],因此本研究选用SLE为疾病对照组。首先通过透射电镜对提取的外泌体进行形态学鉴定,可见圆形或类圆形微小囊泡,粒径在100 nm左右,与已有报道相符[3-4]。纳米粒径分析仪进行血清外泌体浓度分析,结果显示RA和SLE组浓度水平显著高于HC组(P<0.05),但RA与SLE两组无显著差异(P>0.05)。Shu等[19]对胆管癌、胰腺癌、普通胆管结石患者胆汁和血清中外泌体浓度进行比较,发现不同疾病之间胆汁外泌体浓度无显著差异,胰腺癌、普通胆管结石患者血清外泌体浓度无显著差异。因此推测外泌体浓度检测可作为疾病状态的判断,不能单独用于RA的特异性诊断。

用RT-qPCR方法分析lncRNAHotair、XIST、H19和MALAT1在3组研究对象血清外泌体中的表达水平,结果显示H19和MALAT1均低表达且3组间无显著差异(P>0.05),Hotair和XIST在RA组显著高表达(P<0.001)。Song等[20]已证实Hotair可以激活成纤维细胞样滑膜细胞和破骨细胞中的MMP-2和MMP-13,并促进骨、软骨基质溶解和关节破坏。Bost等[21]证实XIST在RA患者成纤维细胞样滑膜细胞和破骨细胞中过表达,促进炎症和增殖信号通路因子表达上调。因此推测RA患者外周血清外泌体中Hoair和XIST的表达增高可能与RA患者发病机制有关。

进一步使用ROC曲线评价血清外泌体lncRNAHotair和XIST对RA的诊断价值,AUCROC分别为0.84和0.76,均具有较高的敏感性和特异性,并且两者均与ESR、CRP和DAS-28呈正相关关系,提示2种LncRNA与RA疾病活动度存在正相关性。但本研究中缺少RA患者治疗前后血清外泌体Hotair和XIST表达差异分析,无法确定药物治疗是否产生影响,下一步将进一步明确用药前后2种血清外泌体lncRNA表达量的相互关系,从而提升诊断和预后价值。