Na+、K+ 、温度和pH对乌苏里拟鲿精子活力的影响

沈方方，武慧慧，张佳鑫，陈军平，赵道全，2，孙文喜，2

(1.河南省农业科学院长垣分院，河南长垣453400；2.河南省农业科学院，郑州450000)

乌苏里拟鲿(Pseudubagrusussuriensi)，俗称牛尾巴，隶属于鲇形目(Silurformes)鲿科(Bagridae)拟鲿属，在我国各大水系均有分布。其肉质细腻，味道鲜美，且无肌间刺，营养价值高，深受养殖者和消费者的青睐。早期，拟鲿的野生资源十分丰富，仅次于同科的黄颡鱼，但由于过度捕捞和生境破坏等因素，野生资源日益减少，目前，在自然水域中已很难收集到野生个体[1]。因此，加强乌苏里拟鲿人工繁育及集约化养殖除了能满足市场消费需求外，对保护其野生种质资源也具有重要意义。

鱼类精子活力与受精力密切相关，被认为是评价鱼类精子质量最好的评价指标，也是人工授精和精液保存的基础[2]。研究表明，对乌苏里拟鲿的研究工作从2001年开始，多集中在人工繁育[3，4]、生物遗传学[5，6]、养殖生物学[7，8]、饲料营养学[9，10]等方面，关于精子活力方面的研究至今未见报道。精子活力除了受亲鱼质量、性腺发育程度等内在因素影响外，还会受到渗透压、pH、温度、离子等环境因子的影响[11，12]。近年来，针对赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)、拟赤梢鱼(Pseudaspiusleptocephalus)、瓦氏雅罗鱼(Amuride)、萨罗罗非鱼(Sarotherodonmelanotheron)等多种鱼类开展了精子活力的相关研究[13-16]，并筛选出精子激活介质中适宜的离子浓度、温度、pH等相关指标，为其人工繁殖和资源保护提供了理论基础。乌苏里拟鲿的规模化繁殖仍依赖于人工授精，且其无法体外取精，只能通过杀鱼取精的方式获得精液，因此对乌苏里拟鲿精子活力的要求极其重要。本研究对比分析了不同浓度Na+溶液、K+溶液、温度和pH对乌苏里拟鲿精子活力的影响，旨在为乌苏里拟鲿人工繁殖提高受精率提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在繁殖季节(6月中旬)，自河南省农业科学院长垣分院水产基地随机选取6尾体格健壮、健康无伤、成熟度好的3龄乌苏里拟鲿雄鱼，体长30～35 cm，体质量0.5～1.2 kg。

1.2 方法

1.2.1 催产和精液采集

催产药物为宁波生物制药三厂生产的鱼类催产激素。在胸鳍基部，采用二次注射的方法：第一针催产药剂量，促黄体释放激素(LRH-A2)6 μg/kg鱼体重、绒毛膜促性腺激素(HCG)500单位/kg鱼体重；12 h后，注射第二针，促黄体释放激素(LRH-A2)4 μg/kg鱼体重、绒毛膜促性腺激素(HCG)300单位/kg鱼体重；12 h后杀鱼取精。采精前用毛巾擦干鱼体，取精巢放在干净的纱网上包住，将精液挤入干净的离心管中，立即放入4 ℃冰箱保存备用。采集过程避免血、黏液等污染精液，避免沾水。

1.2.2 精子激活液的配置

不同离子浓度的激活液：用去离子水和氯化钠(分析纯)、氯化钾(分析纯)，配置不同浓度溶液，氯化钠浓度为0、10、25、50、75、100 mmol/L，氯化钾浓度为0、20、45、75、100、130 mmol/L 。

不同温度的激活液：将去离子水、玻片放入烧杯后置于热水浴锅或冰水浴锅中调节温度，温度分别设为(4.0 ± 1.0)、(8.0 ± 1.0)、(10 ± 1.0)、(14.0 ± 1.0)、(18.0 ± 1.0)、(21.0 ± 1.0)、(24.0 ± 1.0)、(27.0 ± 1.0)、(30.0 ± 1.0)℃ 。

不同pH值的激活液：不同pH值溶液用0.1 mol/L的 NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl溶液与去离子水配置，pH值由梅特勒-托利多pH 计测定，共设置 8 个梯度pH，分别为4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

1.2.3 精子活力观察

用解剖针蘸取微量精液于载玻片上，用5 mL注射器吸取适量的精子激活液滴加1滴至精液，并迅速用针头将其搅匀，同时用秒表计时，不加盖玻片，于10×40倍光学显微镜(ZEISS)下观察精子的运动状态。参考多个文献中对精子活力的评价标准[16-18]，结合乌苏里拟鲿精子特性，采用快速运动时间(FT)和精子寿命(LT)两个指标进行评价，每个激活液重复6次。

1.3 数据分析

结果以平均值±标准差表示，用 spss 20.0 统计软件进行单因素方差分析(one-Way ANOVA)，用Duncan法进行多重比较，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 Na+ 对乌苏里拟鲿精子活力的影响

Na+浓度对乌苏里拟鲿精子活力的影响如表1所示。在Na+浓度为10～50 mmol/L的溶液中，随着Na+浓度的增加，精子活力逐渐增强；Na+浓度为50 mmol/L时，精子活力最强，快速运动时间为(33.0 ± 5.7)s，寿命时间为(67.3 ± 10.4)s，激活时整体运动剧烈。Na+浓度为25 mmol/L时，寿命时间与50 mmol/L组无显著差异外，显著高于其他浓度组；Na+浓度增加到100 mmol/L时，精子活力下降明显，显著低于其他浓度组。适宜的Na+浓度可以延长拟鲿精子活力寿命。

表1 乌苏里拟鲿精子在不同浓度 Na+ 溶液中的活力Tab.1 Sperm viability of P.ussuriensi in different concentrations of Na+ solution

2.2 K+ 对乌苏里拟鲿精子活力的影响

K+浓度对乌苏里拟鲿精子活力的影响如表2所示。K+浓度为45 mmol/L时，精子活力最强，寿命时间为(68.2 ± 12.6)s，随着浓度升高，寿命时间显著下降，K+浓度为100 mmol/L或以上时，精子完全失活。适宜K+浓度对乌苏里拟鲿精子活力存在激活作用。

表2 乌苏里拟鲿精子在不同浓度 K+ 溶液中的活力Tab.2 Sperm viability of P.ussuriensi in different concentrations of K+ solution

2.3 温度对乌苏里拟鲿精子活力的影响

温度对乌苏里拟鲿精子活力的影响如表3所示。当温度在4～21 ℃时，随着温度的升高，乌苏里拟鲿精子活力变化不明显，当温度高于21 ℃时，精子活力降低，寿命时间缩短。表明乌苏里拟鲿精子在4～21 ℃时活力较强，但整体差异不大。

表3 乌苏里拟鲿精子在不同温度下的活力Tab.3 Sperm viability of P.ussuriensi at different tmperature

2.4 pH对乌苏里拟鲿精子活力的影响

pH对乌苏里拟鲿精子活力的影响如表4所示。pH为4～11时，随着pH的升高精子活力先增强后减弱，当pH为8时，精子活力最强，快速运动时间和寿命时间分别为(31.5 ± 5.6)s、(65.3 ± 6.9)s，均显著高于pH 4～5和pH 10～11时。结果表明，精子适宜pH值为7～8。

表4 乌苏里拟鲿精子在不同pH下的活力Tab.4 Sperm viability of P.ussuriensi at different pH

3 讨论

3.1 Na+ 、K+ 对乌苏里拟鲿精子活力的影响

渗透压是精子维持活力的主要因素，其大部分能量消耗在渗透压调节上。Na+、K+是组成鱼类精浆的重要物质也是调节细胞内外渗透压的重要因素，可以通过选择适宜的Na+、K+浓度来提高精子活力和延长精子寿命时间[17，19]。研究表明淡水鱼类精子被激活的适宜Na+浓度范围是50～120 mmol/L，如拉式鱥(Phoxinuslagowskii)[17]、翘嘴红鲌(Erythroculterilishaeformis)[20]、多线盘鮈(DiscogobiomultilineatusCui)[21]、齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[22]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[23]、大口鲇(SilurusmeriordinalisChen)[24]等(表5所示)，在其Na+浓度最适条件下，精子被激活时活力最强。本研究表明，乌苏里拟鲿精子的Na+最适浓度为50 mmol/L，与同属鲇形目的黄颡鱼和大口鲇接近，三者的精子快速运动时间也较接近。生存环境要求相近的鱼类，可能其精子对Na+浓度的适应性较为接近，但关于其影响机制的报道较少，还需要进一步研究。

表5 几种淡水鱼类精子最适Na+ 、K+浓度Tab.5 The most appropriate concentration of Na+ and K+ for the sperm vitality of several fishes

K+浓度对鱼类精子活力的影响有很大差异(表5所示)，在鲑科和鲤科鱼类中研究较为深入，K+对鲑科鱼类精子活力存在一定的抑制作用，但对鲤科鱼类精子活力存在明显的促进作用[16，19，20]。MORISAWA等[25，26]、BAYNES等[27]研究表明，精液中较高浓度的K+是抑制鲑科鱼类精子活力的主要因素，当精液排入淡水使K+浓度降低后，精子便被激活，如虹鳟(SalmongairdneriiRichardson)和大马哈鱼(Oncorhynchusketa)；在鲤科鱼类中，如拉氏鱥[17]、湖拟鲤(Rutilusrutiluslacustris)[19]、乌原鲤(Procyprismterus)[28]、大鳞鲃(Barbuscapito)[29]、彩鲫(Cruciancarp)[30]等，稀释液中适宜的K+浓度能增强鱼类精子的活力，延长其寿命时间。本研究表明，K+促进乌苏里拟鲿精子活力的最适浓度为45 mmol/L，较高的K+浓度导致精子活力降低或失活，可能是由于渗透压调节消耗的能量过多或渗透压太大直接导致细胞结构受损而死亡，类似于理科鱼类，而有别于鲑科鱼类。

3.2 温度对乌苏里拟鲿精子活力的影响

温度是影响精子活力的主要环境因素之一，但具体机制尚不明确，鱼类精子的能量资源有限，温度升高促进精子活力的同时会降低精子寿命时间，与一般认为的“高温促进精子活力，低温抑制精子活力”的结论相符[31，32]。这种现象可能原因是温度通过改变精子内酶的活性及代谢水平进而影响精子活力。多数鱼类精子活力随着温度的升高而增强，到达最适温度后，随着温度的升高精子活力会显著减弱，如北方须鳅(Barbatulabarbatulanuda)(最适温度 5～20 ℃)[33]、圆斑星鲽(Veraspervariegatus)(最适8～12 ℃)[34]、拉氏鱥(最适20 ℃±1.0 ℃)[17]、点篮子鱼(Siganusguttatus)(最适20～25 ℃)[35]、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)(最适 25～31 ℃)[36]等。本研究结果表明，整体来看温度对乌苏里拟鲿精子活力的影响差异不显著，可能其精子对温度变化的耐受性较强，适应范围较广。研究还发现，4 ℃时精子活力较高，寿命时间最长，可能是低温抑制了精子新陈代谢的速度，能量消耗速度减缓或低温条件下，精子运动频率降低，使寿命延长[12，17，33]。因此，在人工授精过程中，低温保存对维持精子活力和提高受精率具有重要作用。

3.3 pH对乌苏里拟鲿精子活力的影响

大多数淡水鱼类精浆pH界于7.0～9.0，偏碱性，精子在中性或偏碱性的溶液中活力较强且受精率较高，酸性溶液会降低或抑制精子活力和受精率[37]。齐口裂腹鱼[22]、瓦氏雅罗鱼(Amuride)[15]在pH 7.0的条件下精子活力最强，拉氏鱥[17]、湖拟鲤[19]、多线盘鮈[21]、点篮子鱼[35]精子活力的最适pH为8.0，而斜带石斑鱼精子活力最强时的pH 值为8.4[36]，虹鳟的精子活力和受精率在pH 9.0时达到最高[35]，大多数鱼类精子活力的适宜pH与精浆的pH范围一致。本研究结果表明，乌苏里拟鲿的适宜pH为7～8，在pH 8.0时精子活力最强且寿命时间最长。表明乌苏里拟鲿在人工授精时，选择偏碱性的水环境较为合适。

4 结论

本研究结果表明，乌苏里拟鲿精子活力的适宜Na+浓度为25～75 mmol/L，最适为50 mmol/L，K+最适浓度为45 mmol/L，在配置精子保存液和稀释液时可供参考。建议在开展人工繁殖的过程中，精液在4 ℃保存，受精水环境在21 ℃左右，pH在7～8。