虹鳟杀鲑气单胞菌耐药性研究与盐酸多西环素给药方案制定

刘 博，张 培，彭嘉琪，程 波，赵雅贤，穆迎春，孙慧武

(1.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心，上海201306；2.中国水产科学研究院，农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京100141；3.中国水产科学研究院北戴河中心实验站，河北秦皇岛066100)

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)隶属于鲱形目鲑科，是世界上养殖最多的鱼类之一[1]，在我国20多个省(市)均有养殖[2]。随着养殖规模逐渐扩大，水质环境恶化、养殖品质下降、流行性暴发性病害频发等问题，极大地阻碍了虹鳟养殖业的健康持续发展[3]。其中杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)引起的疖疮病是虹鳟养殖过程中常见的细菌病之一[4]。

杀鲑气单胞菌属于气单胞菌属(Aeromonas)，广泛分布在自然环境中，是气单胞菌属最早发现报道的病原菌之一[5]。杀鲑气单胞菌经过皮肤、鳃、口及血液等多种途径感染鱼类，导致鱼类产生疖疮病或溃疡病[6]。随着水产养殖规模的不断扩大、集约化程度越来越高，杀鲑气单胞菌引起的病害也日益严重，在鲤(Cyprinuscarpio)[7]、斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)[8]、乌鳢(Channaargus)[9]、大西洋鲑(Salmosalar)[10]和石斑鱼(Epinephelussp)[11]上均有报道感染案例，且近年危害波及海水和淡水，野生和养殖等各种鱼类[12-13]。杀鲑气单胞菌可以感染哺乳动物和人类引发疾病，存在人-兽传播风险[14]。杀鲑气单胞菌还可同气单胞菌属中的温和气单胞菌和嗜水气单胞菌等导致混合感染，造成养殖鱼类短时间内大量死亡[15]。近年来，杀鲑气单胞菌携带抗生素耐药基因的质粒已完全被鉴定出来，可能对四环素、氟苯尼考、氯霉素、磺胺类、氨苄青霉素、羧苄青霉素、链霉素和大分子霉素产生耐药性，而且携带耐药基因的质粒很可能会转移到其他细菌中，产生相同的耐药性，对畜牧业和人类带来危害[16]。

目前水产养殖中治疗杀鲑气单胞菌病等细菌性疾病主要依赖抗生素，在实际用药过程中，因病原耐药性的产生、科学用药理论未能及时研究更新等因素，抗生素的使用具有盲目性，滥用抗生素、超剂量使用抗生素、不遵守休药期等问题普遍发生，导致耐药性的产生和药物残留超标等问题较为突出[17]。如何科学使用抗生素治疗细菌性疾病成为行业的迫切需求。本研究以虹鳟杀鲑气单胞菌病为研究对象，通过体外药敏实验，了解其耐药性现状，筛选出有效治疗疖疮病的药物，并通过构建虹鳟杀鲑气单胞菌人工感染模型，探究药物在病鱼体内的药代动力学特征，研究既能达到治疗效果又能最大限度降低耐药性产生的药物使用剂量，以期为制定虹鳟杀鲑气单胞菌病科学合理的用药方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验虹鳟及菌株

实验用虹鳟由北京市房山区海墨威养殖场提供，体质量为(200±20)g，暂养一周后挑选活跃且体表无伤痕的实验鱼进行口灌采样工作，养殖水温(16.0±0.5)℃。

实验菌株为3株分别分离自2019年、2020年和2021年患病虹鳟的杀鲑气单胞菌，由中国水产科学研究院黑龙江水产研究所捐赠，分别命名为AS19、AS20和AS21。

1.2 材料与仪器

水解酪蛋白胨(MH)琼脂培养基和肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；LB肉汤培养基和LB营养琼脂购自青岛海博生物技术有限公司；盐酸多西环素标准品、硫酸新霉素标准品、恩诺沙星标准品和氟苯尼考标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；药敏片购自杭州微生物试剂有限公司；盐酸多西环素原药购自上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸、磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸二钠均购自阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷和甲酸均购自Fisher，色谱纯。

台式高速低温离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；无菌超净工作台(日本Hitachi公司)；恒温培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司)；恒温摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；多管涡旋混合仪(莱普特科学仪器(北京)有限公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)；超声波清洗机(江苏昆山超声仪器有限公司)；Xevo TQ-XS三重四级杆液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司)；电子分析天平(日本Shimadzu公司)。

1.3 杀鲑气单胞菌对抗生素的耐药性与体外药效测定

1.3.1 杀鲑气单胞菌的耐药性

采用纸片扩散法(K-B法)对3株杀鲑气单胞菌进行敏感性测定，将浓度为1×108CFU/mL菌株均匀涂布于MH琼脂培养基平板，倒置15 min后，将药敏纸片贴于培养基表面。20 ℃培养24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，重复三次实验，计算平均值[18]。采用E.coliATCC25922菌株进行药敏实验质控。

1.3.2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定方法

参考美国临床和实验标准化委员会颁定的标准[19]，采用微量肉汤稀释法测量盐酸多西环素、恩诺沙星、硫酸新霉素和氟苯尼考4种药物对3株杀鲑气单胞菌的MIC和MBC。将4种抗生素标准品以二甲基亚砜(DMSO)溶剂作为助溶剂，分别配制成浓度为1 280 μg/mL的储存液。正式实验时用MH肉汤分别稀释药物浓度，稀释成浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL的药液备用。制备浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1∶1 000稀释后备用，最终菌液浓度在1×105CFU/mL。将不同浓度的抗菌药物溶液，分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔100 μL，同时第1至第11孔加入100 μL菌悬液，使每孔中最终药物浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/mL，第12孔加入200 μL菌液，不加药物作为生长对照，密封后置于20 ℃培养箱中，孵育24 h判断结果。以96孔板中未变浑浊无细菌生长的浓度判定为最小抑菌浓度(MIC)[20]。继续培养24 h后，每个孔吸取100 μL涂布平板，24 h后菌落数小于5的最低药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)，重复实验3次[21]。

1.3.3 防耐药突变浓度(MPC)和耐药突变选择窗(MSW)

以杀鲑气单胞菌菌株AS21作为研究对象，采用含药琼脂平板法测定防耐药突变浓度(MPC)。将单个病原菌AS21接种于MH肉汤培养基中，放置于20 ℃、180 r/min摇床中培育24 h，采用平板计数法对菌液进行计数。计数后将菌液放置于离心机中5 000 r/min转速离心10 min，将菌液浓度浓缩至1×1010CFU/mL，吸取100 μL涂布于含有1、2、4、6、8、10、12和16倍MIC药物浓度的含药平板上，每个药物浓度4个平行，20 ℃恒温培养箱中培育72 h，观察平板有无菌落生长，得出菌落生长与不生长的浓度范围。根据此浓度范围细化含药平板浓度，重复一次实验过程，平板无菌落生长的最低药物浓度即为防耐药突变浓度(MPC)。最小抑菌浓度到防耐药突变浓度之间的范围即为耐药突变选择窗(MSW)。

1.3.4 半致死浓度的测定以及人工染病模型的建立

将健康虹鳟分为6组，每组10尾，养殖水温(16±0.5)℃。其中5组从腹腔分别注射浓度为1×108、1×107、1×106、1×105和1×104CFU/mL的AS21菌液0.2 mL，命名为实验组A、B、C、D和E，第6组注射0.2 mL生理盐水作为空白对照组。分别在注射后1、2、4、6、8、12、18、24、36、48、72和96 h观察记录各组鱼体发病和死亡数量。计算半数致死量(LD50)。

以LD50剂量杀鲑气单胞菌菌液腹腔注射健康虹鳟，24 h后挑选具明显发病症状的个体260尾作为疾病感染模型，进行后续给药实验

1.4 盐酸多西环素在患病虹鳟体内的药代动力学研究

1.4.1 给药实验设计

将虹鳟疾病感染模型分为4组，每组65尾，分别按照20、30、40和60 mg/kg剂量进行盐酸多西环素单次灌给药，同时在药液中加入一定量的饲料粉末，于给药后0.167、0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、48、72和96 h进行鱼体血液、肝脏、肾脏、肌肉样本采集，每个时间点每组分别采集5尾。血液采用尾静脉取血后，置于含有1%肝素钠的离心管中，8 000 r/min离心10 min，取上清保存；肝脏、肾脏和肌肉采集后均质。所有样品-40 ℃保存待测。

1.4.2 样品前处理

样品检测参照GB 31656.11-2021《食品安全国家标准 水产品中土霉素、四环素、金霉素、盐酸多西环素残留量的测定》进行。

准确量取样品[血浆0.2 mL，肌肉(2.00±0.02)g，肝脏(0.50±0.02)g，肾脏(0.50±0.02)g，各组织独立检测]置于50 mL离心管中，加入Na2EDTA-McLLvaine缓冲溶液6 mL，醋酸铅溶液2 mL，涡旋混匀5 min，超声波提取10 min，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，吸取上清液至另一50 mL离心管中；残渣重复提取2次，合并3次提取液。血浆提取液直接进行固相萃取。肌肉、肝脏和肾脏的提取液中加入10 mL正己烷，涡旋混匀5 min，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，取下层清液进行固相萃取。

固相萃取分为活化、上样、淋洗和洗脱4步。向固相萃取柱中依次加入5 mL甲醇和5 mL水进行活化，活化完成后加入10 mL样品备用提取液上样，控制流速约1 mL/min，之后依次使用5 mL水和5 mL甲醇溶液淋洗固相萃取柱，弃去全部液体，减压抽干5 min，最后使用5 mL甲醇-乙酸乙酯洗脱，使用15 mL离心管收集洗脱液。洗脱液于40 ℃以下氮吹至近干，加入1 mL甲酸溶液(0.1%)-乙腈溶液溶解残留物，涡旋5 min，过0.22 μm微孔滤膜后，使用液相色谱-串联质谱法测定。

1.4.3 色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱为C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)，流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈，进样体积为10 μL，柱温30 ℃，流速为0.3 mL/min。

质谱条件：喷雾电压4 200 V，离子传输管温度350 ℃，毛细管电压3 000 V，脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂气流量600 L/Hr，锥孔气流量150 L/Hr。

盐酸多西环素定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表1。

表1 盐酸多西环素定性离子对、定量离子对和碰撞能量Tab.1 Doxycycline hydrochloride qualitative ion pairing，quantitative ion pairing，and collision energy

1.4.4 基质标准曲线

采集未给药虹鳟感染模型的血浆、肝脏、肾脏和肌肉作为空白组织样品，按照1.4.2节的样品前处理步骤，得到氮吹之前的空白洗脱液，精密量取盐酸多西环素标准工作液，制备成药物含量为5、10、20、50、100、200、500、1 000和2 000 μg/L的基质混合标准系列工作液，其他前处理步骤同其他样品。以基质混合标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制基质标准曲线，求回归方程和相关系数。

1.4.5 回收率、精密度、检测限(LOD)和定量限(LOQ)

回收率：分别取各组织一定量的空白样品(0.2 mL血浆、2 g肌肉、1 g肝脏和1 g肾脏)，加入一定量的标准品，制备药物含量为10、50、100 μg/L的待测样品，每组6个平行，参照1.4.2样品前处理方法进行前处理，上机检测，得出实际检测浓度，回收率=上机检测浓度/理论浓度×100%。

精密度：日内精密度为将上述用于测定回收率的样品于1天内重复进样三次；日间精密度起将上述用于测定回收率的样品每天进样一次，连续三天进样。计算得出日内变异系数和日间变异系数。

检测限和定量限：将空白样品制成含有低浓度盐酸多西环素的样品，按照“1.4.2样品前处理”中的方法进行样品前处理后上机检测。信噪比(S/N)≥3时药物在样品中的最低浓度为检测限(LOD)，信噪比(S/N)≥10时药物在样品中的最低浓度为定量限(LOQ)。

1.5 数据处理

数据采用Excel、GraphPad Prism 8.0计算时间浓度曲线，采用DAS 2.0软件计算盐酸多西环素药代动力学参数。

2 结果

2.1 药敏实验结果

本研究测定了3株杀鲑气单胞菌对24种药物的敏感性,药敏实验结果见表2。其中,3株杀鲑气单胞菌对头孢哌酮、硫酸新霉素、头孢呋辛、头孢他啶、阿奇霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、恩诺沙星、头孢噻肟、庆大霉素、四环素、盐酸多西环素、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素和氟苯尼考共17种药物高度敏感;对复方新诺明、磺胺异恶唑、青霉素、阿莫西林、头孢唑林共5种药物耐药;对哌拉西林和链霉素2种药物敏感状态不一致。

表2 3株杀鲑气单胞菌的药敏实验结果Tab.2 Susceptibility test results of 3 strains of A.salmonicida

根据药敏实验判定标准和《水产养殖用药明白纸2022年1、2号》，筛选出4种对杀鲑气单胞菌敏感、且批准使用的药物：盐酸多西环素、恩诺沙星、硫酸新霉素和氟苯尼考。

2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

盐酸多西环素、恩诺沙星、新霉素和氟苯尼考4种药物对3株杀鲑气单胞菌的MIC及MBC结果见表3。结果表明，对杀鲑气单胞菌AS19，盐酸多西环素抑杀效果最明显，恩诺沙星和氟苯尼考的抑杀效果次之，硫酸新霉素抑杀效果最弱；对杀鲑气单胞菌AS20，恩诺沙星的抑杀效果最明显，盐酸多西环素的抑杀效果略低于恩诺沙星，氟苯尼考和硫酸新霉素的抑杀效果次之；对杀鲑气单胞菌AS21，盐酸多西环素与恩诺沙星的MIC相同，盐酸多西环素的MBC略低于恩诺沙星的MBC，氟苯尼考和硫酸新霉素的抑杀效果次之。

表3 4种抗生素对3株杀鲑气单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度Tab.3 MIC and MBC of 4 antibiotics against 3 strains of A.salmonicida μg/mL

整体而言，对于3株杀鲑气单胞菌，盐酸多西环素的最小抑菌浓度为0.5 μg/mL，最小杀菌浓度在2～4 μg/mL之间；恩诺沙星的最小抑菌浓度在0.25～1 μg/mL之间，最小杀菌浓度为4 μg/mL；氟苯尼考的最小抑菌浓度为1 μg/mL，最小杀菌浓度为8 μg/mL；硫酸新霉素最小抑菌浓度为4 μg/mL，最小杀菌浓度为8 μg/mL。

2.3 防耐药突变浓度和耐药突变选择窗

盐酸多西环素、恩诺沙星、新霉素和氟苯尼考4种药物对杀鲑气单胞菌AS21的MPC和MSW的结果见表4。结果显示盐酸多西环素对杀鲑气单胞菌AS21的耐药突变范围更狭窄，细菌不发生耐药突变的浓度更低。

表4 4种抗生素对杀鲑气单胞菌AS21的防耐药突变浓度和耐药突变选择窗Tab.4 MPC and MSW of 4 antibiotics against A.salmonicida AS21 μg/mL

对于4种实验药物，综合最小抑菌浓度、最小杀菌浓度和防耐药突变浓度3个指标，盐酸多西环素最小抑菌浓度和最小杀菌浓度相对较低，防耐药突变选择窗更狭窄，盐酸多西环素作为后续用药为优先考虑对象，并以此开展后续不同浓度给药药代动力学实验。

2.4 杀鲑气单胞菌对虹鳟的半致死浓度及病症

虹鳟感染杀鲑气单胞菌后，鱼体发病症状如图1。鱼体表出现小疖疮伴有出血，疖疮下化脓溃烂，肌肉液化，剖检发现腹腔内有黄色积液，肝、肾和脾等内脏器官肿大出血、肝脏发白等症状，符合虹鳟感染杀鲑气单胞菌的常见症状。不同浓度菌株感染后96 h虹鳟死亡数据见表5。计算得出杀鲑气单胞菌AS21对虹鳟的半数致死量(LD50)为1×104CFU/g。

图1 虹鳟人工感染杀鲑气单胞菌AS21的发病症状Fig.1 Symptoms of artificial infection with A.salmonicide AS21 in rainbow trout

表5 虹鳟人工感染不同浓度杀鲑气单胞菌AS21 96 h后的死亡率Tab.5 Mortality after 96 hours of artificial infection with A.salmonicide AS21 in rainbow trout

2.5 液相色谱串联质谱方法验证

4种组织中盐酸多西环素的加标回收率在78.88%～115.83%之间，日内变异系数均小于6%，日间变异系数均小于7%，检测方法具有较高的可靠性。按照信噪比S/N=3为检测限(LOD)，S/N=10为定量限(LOQ)，此方法求得检测限为5 μg/kg(血浆为5 μg/L)，定量限为10 μg/kg(血浆为10 μg/L)。盐酸多西环素的峰面积为纵坐标，以盐酸多西环素基质加标浓度为横坐标，基质标准曲线在10～2 000 μg/L范围内呈现良好的线性关系。

2.6 4种剂量下盐酸多西环素在染病虹鳟各组织中的药时曲线与药代动力学特征

4种给药剂量下盐酸多西环素在染病虹鳟不同组织中的药物浓度与时间的关系见图2。盐酸多西环素主要分布在肝脏中，其次为肾脏。不同浓度盐酸多西环素在患病虹鳟各组织内药物浓度随时间变化的趋势基本一致，呈现双峰现象，且随着盐酸多西环素浓度的增加，双峰现象愈加明显。

图2 4种剂量下盐酸多西环素在染病虹鳟4种组织内的药时曲线与MIC和MPC的关系图Fig.2 Relationship between doxycycline hydrochloride and MIC and MPC in four tissues infected with rainbow trout at four doses

20 mg/kg盐酸多西环素给药后24 h内，血浆和肌肉中不能达到体外药效学中的MIC(0.5 μg/mL)和MPC(1 μg/mL)；肾脏中能维持在MIC浓度以上17 h，MPC浓度以上1 h；肝脏中能维持在MIC浓度以上23.5 h，MPC浓度以上23 h。

30 mg/kg盐酸多西环素给药后24 h内，肌肉中不能达到体外药效学中的MIC和MPC；血浆中能维持在MIC浓度以上2 h，不能达到MPC；肾脏中能维持在MIC浓度以上23.5 h，MPC浓度以上11.5 h；肝脏中能维持在MIC浓度和MPC浓度以上的时间均超过23.5 h。

40 mg/kg盐酸多西环素给药后24 h内，肌肉中不能达到体外药效学中的MIC和MPC；血浆中能维持在MIC浓度以上16 h，MPC浓度以上2 h；肾脏中能维持在MIC浓度以上23.5 h，MPC浓度以上17 h；肝脏中能维持在MIC浓度和MPC浓度以上的时间均超过23.5 h。

60 mg/kg盐酸多西环素给药后24 h内，肌肉中能维持在MIC浓度以上18 h，不能达到MPC；血浆中能维持在MIC浓度以上23 h，MPC浓度以上6 h；肾脏和肝脏中能维持在MIC浓度和MPC浓度以上的时间均超过23.5 h。

4种给药剂量下盐酸多西环素在虹鳟血液中的药代动力学参数见表6。血浆内的盐酸多西环素达峰浓度与给药剂量成正比，且随着给药剂量增加，其达峰时间逐渐增加，从2 h(20 mg/kg)增加到4 h(30～60 mg/kg)，达峰浓度依次为0.49 、0.54、1.19和1.41 μg/mL。

表6 四种剂量下盐酸多西环素在染病虹鳟血浆中的药代动力学参数Tab.6 Pharmacokinetic parameters of doxycycline hydrochloride in plasma infected rainbow trout at four doses

3 讨论

3.1 杀鲑气单胞菌的耐药性

本研究结果表明，3株菌株对复方新诺明、磺胺异恶唑和青霉素等5种水产养殖常用抗菌药物耐药，如果仍然沿用传统用药指南，恐难达到有效治病的目的。3株菌株对硫酸新霉素、恩诺沙星及盐酸多西环素等17种药物高度敏感，但AS19对哌拉西林高度敏感，而AS20和AS21仅呈现中度敏感；AS19对链霉素呈现中度敏感，而AS20和AS21则呈现高度敏感，不同年份3株菌对哌拉西林和链霉素表现出不同差异特征。有关云南省虹鳟源杀鲑气单胞菌耐药性研究与本结果基本一致，但在硫酸新霉素上，菌株耐药[22]与本研究3株菌对硫酸新霉素均高度敏感不一致。硫酸新霉素是目前我国已批准使用的12种抗生素之一，这种差异，可能与不同地区常用药物种类不同，但更可能与地域差异相关。异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)源杀鲑气单胞菌对硫酸新霉素中度敏感，对氟苯尼考耐药[23]，但斑点叉尾源杀鲑气单胞菌耐药性与本研究结果一致[8]。这些不同品种、不同地区、不同年份研究的差异，充分说明了病原菌耐药的复杂性，水产养殖中采用单一给药方案全国通用，难以获得较好效果。

防耐药突变浓度(MPC)是一个防止耐药的抗菌药物浓度阈值，即防止细菌产生耐药性的抑制细菌生长的药物浓度，是评价抗菌药物抑制细菌生长效应的指标，反映的是药物抑制细菌发生耐药突变的能力[24]。患病机体内的药物浓度在MIC和MPC之间时，药物可以抑制和杀灭大部分细菌，但同时耐药细菌在此阶段可能因药物刺激发生第一次突变，导致耐药性的产生，此阶段浓度范围即为细菌耐药突变选择窗(MSW)[25]。依次理论，选择MPC较低，MSW范围较窄的药物，可以最大程度避免耐药性的产生。本研究盐酸多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考和硫酸新霉素药效学结果表明，盐酸多西环素的MPC相较于其他3种药物最低，MSW范围最窄，产生耐药性的风险更低；硫酸新霉素MPC相较于其他3种药物最高，MSW范围最宽，产生耐药性的风险更高。异育银鲫源和云南省虹鳟源杀鲑气单胞菌对硫酸新霉素分别呈现中度敏感和耐药[8，23]，充分印证了本研究硫酸新霉素对杀鲑气单胞菌耐药选择窗范围较宽，更易产生耐药性的结果。

杀鲑气单胞菌引起病害主要源于杀鲑亚种(Almonicida)、杀日本鲑亚种(Msoucida)、无色亚种(Achromogenes)、史氏亚种(Smith)和溶果胶亚种(Pectinolytica)五种亚种[15]。杀鲑气单胞菌是鲑鳟鱼类主要病原菌，作为一种高致病力的条件致病菌，本研究进一步印证了不同地域、不同物种、不同养殖类型和不同用药情况均会使杀鲑气单胞菌耐药性发生变化[26]。甚至分离自同种类不同养殖年份病原，其耐药性也有差异。养殖生产中，应根据不同地区、不同养殖品种，在未知耐药性情况下，应针对病原做好耐药性基础研究，依此针对性选择抗菌药物。

3.2 药代动力学特征

药代动力学研究中感染模型的建立至关重要。本研究通过人工回感实验，建立虹鳟杀鲑气单胞菌模型，复刻典型症状，并通过不同剂量盐酸多西环素口灌给药，探究虹鳟实际感染杀鲑气单胞菌下盐酸多西环素的药代动力学特征。虹鳟各组织中盐酸多西环素给药剂量与达峰浓度成正比，且血浆中药物浓度随给药剂量增加，其达峰时间逐渐增加，从2 h(20 mg/kg)增加到4 h(30～60 mg/kg)。肌肉中药物达峰浓度在4种组织中最低，表明药物较难达到肌肉组织。但随着给药浓度的增加，峰值浓度呈现正向增加，达峰时间可能因鱼体患病在肌肉中的损伤程度不同而没有很强的规律性。肾脏中达峰时间最短，肝脏中达峰浓度最高，其浓度远高于其他3种组织，说明盐酸多西环素可能通过肝脏进行代谢。不同浓度盐酸多西环素在患病虹鳟各组织内药物浓度随时间变化的趋势基本一致，呈现“双峰现象”，且随着盐酸多西环素浓度的增加，“双峰现象”愈加明显。可能与肝肠循环、多部位吸收、药物对胃肠的刺激等因素有关[27]。

本研究中，虹鳟血浆中盐酸多西环素达峰浓度明显低于同剂量下的健康异育银鲫[22]和斑点叉尾[28]中的达峰浓度，达峰时间也有一定的延后。研究表明，疾病感染会使鱼体生理、生化机能和器官功能状态等均处于应激和病态，导致其对药物的吸收能力下降，上述差异，可能与本研究所用感染模型有关。另一方面，盐酸多西环素代谢动力学过程可能与温度呈正相关代谢，达峰时间、达峰浓度与温度呈现正相关[29]，本研究虹鳟为冷水性鱼类，可能这种不同物种及养殖温度的差异，也一定程度导致了差异的产生。黄聚杰[30]对盐酸多西环素在花鲈(Lateolabraxmaculatus)体内的药代动力学研究表明，20 mg/kg口灌盐酸多西环素时，花鲈血浆、肾脏和肝脏中药物浓度在3 h时同时达到峰值，肌肉中药物浓度在9 h时达到峰值，且肾脏中的峰值浓度最高，4种组织内的峰值浓度均大于本实验中虹鳟体内的峰值浓度，且没有“双峰现象”。上述现象与本研究及上述异育银鲫、斑点叉尾等存在诸多差异，可能与海淡水养殖环境或鱼类种属差异相关，有待进一步研究确认。

3.3 给药方案

盐酸多西环素为时间依赖性药物，当T>MIC占给药间隔时间的比例超过40%，同时实验动物模型存活率在90%以上，药物对细菌的抑杀才有良好效果[31-32]。药物浓度在MPC浓度之上时，可以极大避免病原菌产生耐药性。20、30、40和60 mg/kg盐酸多西环素在患病虹鳟体内的血药浓度大于MIC的持续时间分别为0、2、16和23 h，血药浓度大于MPC的持续时间分别为0、0、2和6 h；肌肉中的药物浓度大于MIC的持续时间仅在口灌剂量60 mg/kg时能达到18 h，4种剂量均不能达到MPC浓度。20、30、40和60 mg/kg盐酸多西环素在患病虹鳟肾脏中的药物浓度大于MIC的持续时间分别为17、23.5、23.5和23.5 h，大于MPC的持续时间分别为1、11.5、17和23.5 h；肝脏中药物浓度大于MIC和MPC的持续时间均在23 h以上。现行中华人民共和国水产行业标准SCT1132 -2016《渔药使用规范》与农业农村部渔业渔政管理局2022年发布的《水产养殖用药明白纸2022年1号、2号》对盐酸多西环素的建议使用剂量均为20 mg/kg，每日1次，连用3～5天。根据此研究结果，按此推荐使用剂量，恐不能满足对患病虹鳟的治疗作用。

综合MIC和MPC与不同剂量盐酸多西环素在血浆中的药时曲线对比，单次口灌40 mg/kg剂量下，患病虹鳟中血药浓度可以达到MIC并持续16 h以上，可以满足虹鳟杀鲑气单胞菌病治疗需要。若综合考虑不同剂量盐酸多西环素在血浆、肌肉、肾脏和肝脏中的药物浓度，单次口灌60 mg/kg剂量，在治疗杀鲑气单胞菌病达到较好效果的同时，可以维持在防耐药突变浓度之上较长时间，防止杀鲑气单胞菌产生耐药性。

4 结论

(1)头孢哌酮、硫酸新霉素、头孢呋辛、头孢他啶、阿奇霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、恩诺沙星、头孢噻肟、庆大霉素、四环素、盐酸多西环素、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素和氟苯尼考共17种药物对本研究3株杀鲑气单胞菌高度敏感；3株杀鲑气单胞菌对复方新诺明、磺胺异恶唑、青霉素、阿莫西林、头孢唑林5种药物耐药。

(2)综合最小抑菌浓度、最小杀菌浓度和防耐药突变浓度3个指标，盐酸多西环素最小抑菌浓度和最小杀菌浓度相对较低，防耐药突变选择窗更狭窄，建议盐酸多西环素为治疗虹鳟杀鲑气单胞菌的优先选择用药。

(3)40 mg/kg剂量单次给药，盐酸多西环素在患病虹鳟血浆中的峰浓度为1.19 μg/mL，达峰时间为4 h，且血药浓度维持在MIC以上16 h，可以满足虹鳟杀鲑气单胞菌病治疗需要。

(4)60 mg/kg剂量单次给药，盐酸多西环素在患病虹鳟血浆、肌肉、肾脏和肝脏中的药物浓度维持在MIC以上的时间分别为23、18、23.5和23.5 h，在血浆、肝脏和肾脏中的药物浓度可以维持在MPC之上的时间分别为6、23.5和23.5 h，此使用剂量既能达到治疗虹鳟杀鲑气单胞菌病的作用，又能有效防止耐药性的产生。