血人参中化学成分鉴定及其保肝活性研究

李开敏，刘育辰，刘 刚，张永萍，王 波

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

肝脏是人体内新陈代谢最活跃的器官，参与物质代谢并具有解毒作用［1］，易受到化学毒素、病原微生物、酒精等因素诱导，引发脂肪肝、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等多种肝病［2］。中药因其具有多成分、多靶点的特点，在保肝方面发挥重要作用。研究显示，血人参乙酸乙酯部位具有体外肝损伤保护作用［3-5］。本研究采用H2O2及油酸诱导HepG2 细胞损伤，用于筛选血人参乙酸乙酯部位具有保肝作用的化合物［6-7］。

血人参含有原花青素类鞣质、黄酮苷类等成分［3-4，8-13］，现代药理研究表明其具有保肝、抗氧化、抗癌、抗病毒、降血糖等作用［14］。血人参目前执行的质量标准为《贵州省中药材、民族药材质量标准》 （2003 年版）［15］，但仅有性状描述，缺少质量控制的化学方法。近年来，超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS） 广泛应用于化学成分研究［16-22］，具有灵敏度高、分辨率高、扫描范围广等特点，可有效识别复杂中药材中的各类成分及其化学结构［23］。本研究以血人参主要药效部位-乙酸乙酯部位为研究对象，采用UPLC-Q-TOF-MS 技术，通过在线数据库匹配、色谱峰的碎片裂解规律分析、参考相关文献和对照品比对，并根据色谱峰、质谱分子离子峰和碎片离子等信息，对化学成分进行结构鉴定和分析，以期为进一步的血人参药效物质基础及质量控制研究提供依据。

1 材料

Acquity UPLC I-CLASS 超高效液相色谱仪、XEVO G2-XS Q-TOF 飞行时间质谱仪（美国Waters 公司）； 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； 酶标仪（multiskan FC 型，美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

原花青素A1（批号CYK-Z1810251，纯度≥98%）、原花青素A2（批号JKCYK-Z2004091，纯度≥98%）、儿茶素（批号ST01600120，纯度≥98%）、原花青素B1（批号CYK-Z0382，纯度 ≥ 98%）、原花青素 B2（ 批号CHB180902，纯度≥98%）、原花青素B3（批号CYKZ0384，纯度≥98%）、表儿茶没食子酸酯（批号BP0539，纯度≥98%）、柚皮素-7-O-葡萄糖苷 （批号BP3263，纯度≥98%）、根皮苷（批号BP1089，纯度≥98%） 对照品均购自武汉琼格生物科技有限公司； 表儿茶素 （批号CHB180831，纯度≥98%） 对照品购自成都克洛玛生物科技有限公司。谷胱甘肽（GSH）、油红（北京索莱宝生物科技有限公司，批号630R059、331K057）； H2O2（国药集团化学试剂有限公司，批号20091021）； 油酸 （美国Sigma-Aldrich 公司，批号20150316215）。血人参购自贵阳德昌祥药业有限公司，经贵州中医药大学王波老师鉴定为豆科木蓝属植物茸毛木蓝IndigoferastachyodesLindl.的干燥根。乙腈、甲酸为色谱纯（美国Tedia 公司）； 水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法

2.1 色谱条件 Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脱（0 ～2 min，2% A； 2 ～4 min，2% ～8% A； 4 ～9 min，8% ～25%A； 9～14 min，25% ～30%A； 14 ～20 min，30% ～65% A； 20 ～27 min，65% ～98% A； 27 ～32 min，98% ～2%A）； 体积流量0.4 mL/min； 柱温35 ℃； 进样量1 μL。

2.2 质谱条件 ESI 离子源； 负离子模式； 锥孔电压25 V； 毛细管电压2.5 kV； 离子源温度120 ℃； 脱溶剂温度400 ℃； 脱溶剂气体积流量1 000 L/h； 采集方式为MSE； 采集时间32 min； 扫描范围m/z100～1 200。

2.3 细胞液制备及细胞株处理 将10 个对照品用DMSO制成相应浓度，加入细胞时用培养液按1 ∶1 000 比例稀释，即得。人肝癌HepG2 细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液（含青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL） 中培养，条件为37 ℃、5%CO2、饱和湿度，再用含0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 溶液消化传代。

2.4 氧化损伤造模 参考文献［24］ 报道，HepG2 细胞接种于96 孔板中，培养24 h 后加入无毒浓度的样品预孵育12 h，设阳性药物对照组（GSH）、溶剂对照组、模型组，每个浓度设3 ～4 个平行孔。12 h 后在96 孔板中避光加入H2O2（终浓度400 μmol/L） 培养12 h，弃去培养液，每孔加入MTT 液（0.5 mg/mL） 100 μL，继续培养4 h，弃去MTT 液，每孔加入DMSO 150 μL，混和振荡器振荡，在酶标仪570 nm 波长处测定光密度（OD） 值，计算细胞存活率。

2.5 油酸诱导的脂肪堆积模型及油红O 染色 参考文献［25］ 报道，HepG2 细胞接种于96 孔板中，培养24 h 后加入无毒浓度的样品、油酸（240 μmol/L），设非诺贝特阳性药物对照组（20 mol/L）、溶剂对照组、模型组，继续作用于细胞24 h，弃去培养液，每孔加入100 μL 胎牛血清，30 s后弃去，重复3 次，再加入100 μL 4%多聚甲醛固定细胞，静置40 min，弃去多聚甲醛，每孔加入100 μL 胎牛血清，30 s 后弃去，重复3 次，每孔加入100 μL 油红染料，置于暗处避光，染色1 h 后弃去染料，每孔加入100 μL 胎牛血清，30 s 后弃去，重复3 次，每孔再加入50 μL 异丙醇，振荡10 min，在酶标仪532 nm 波长处测定OD 值，计算抑制率，公式为抑制率＝ ［（模型组OD 值-给药组OD值） /模型组OD 值］ ×100%。

2.6 供试品、对照品溶液制备

2.6.1 供试品溶液 精密称定药材粉末2 g，置于150 mL量瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，回流提取4 h，滤过，浓缩得浸膏，等量蒸馏水溶解浸膏成混悬状，依次用等量石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层挥干，50% 甲醇溶解制成质量浓度为5 mg/mL 的溶液，50% 甲醇稀释5 倍，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.6.2 对照品溶液制备 精密称取原花青素A1、原花青素A2、儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素B4、表儿茶素、表儿茶没食子酸酯、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、根皮苷对照品各1 mg，50%甲醇溶解，制成质量浓度均为1 mg/mL 的溶液，即得。

3 结果

3.1 成分鉴定 将血人参供试品溶液和混合对照品溶液按“2.1” 和“2.2” 项下检测条件进行UPLC-Q-TOF-MS 分析，得负离子模式下的总离子流图，见图1。色谱分离血人参乙酸乙酯样品得到了比较良好的总离子流色谱图，各峰的分离度均较良好； 负离子扫描模式下检测质量精度良好，能满足通过精确质量数去鉴定分子式、碎片元素组成的要求。根据血人参化学成分的保留时间（tR） 和质谱信息，并结合对照品、相关文献、数据库和二级质谱碎片信息进行比对，共鉴定和推测出了27 个化合物，其中原花青素类鞣质18 个，黄酮苷类4 个。经二次质谱实验，20 min以前以原流动相梯度洗脱，得到与原来一致的总离子流图，增加有机相比例后，未见有意义的成分，因此对照品负离子模式下的总离子流图时间为20 min。保留时间23.95、24.17、24.33、24.83、25.91 min 可能为脂肪酸类化合物，由于该类成分质谱碎片信息有限，几乎无碎片离子，只能确定分子离子，是否有支链及不饱和脂肪酸的双键位置无法确定。化合物鉴定结果见表1。

3.2 裂解规律研究

3.2.1 原花青素类化合物 原花青素又称为缩合单宁［26］，是一类由黄烷-3-醇结构单元通过C-C 键缩合形成的不同聚合度的混合物，按照黄烷-3-醇之间连接方式的不同，分为A 型和B 型，前者由一个碳键C4→C8或C4→C6和一个醚键C2→O→C7连接形成，后者通过一个碳键C4→C8或C4→C6连接形成［27］。其聚合度、单体结构单元以及黄烷间连接类型和位置的变化导致原花青素分子之间存在相当大的结构复杂性和异构性［28］。在血人参中共检测出原花青素单聚体，二聚体和三聚体三种类型。单聚体以化合物2 为例，其保留时间5.18 min，在负离子模式下准分子离子峰为m/z289.071 7 ［M-H］-，分子式为C15H14O6，根据二级质谱图母离子失去一分子H2O 得到m/z271.061 2 离子，再失去一个中性分子C3O2得到m/z203.075 1 离子，母离子失去一个中性分子CO2得到m/z245.089 8 离子，母离子失去二分子C2H2O 得到m/z205.061 7 离子，结合对照品比对及文献［29-31］ 鉴定该化合物为儿茶素。化合物7 的准分子离子峰m/z289.071 7 ［M-H］-与化合物2 相同，其二级质谱裂解碎片也一致，推测二者为同分异构体，根据对照品及文献［32］ 比对，确定化合物7 为表儿茶素。其在负离子模式下的质谱及裂解方式见图2～3。

图2 儿茶素低能量通道（A）、高能量通道（B） 质谱图

在血人参乙酸乙酯部位中检测到原花青素二聚体有A型和B 型，2 种类型原花青素的裂解主要是黄烷间连接键的断裂、逆狄尔斯-阿尔德反应（RDA 反应，发生在C2和O，C3和C4键的断裂）、C 环开环后失去1 个间苯三酚单元。A 型原花青素以化合物19 为例，准分子离子峰为m/z575.120 3 ［M-H］-，产生的二级碎片离子有m/z449.087 9［M-H-C6H5O2］-、RDA 反应得到m/z425.073 8 ［M-HC9H10O3］-、黄烷单元间的共价键断裂和醚键断裂分别得到m/z289.071 9 ［catechin-H］-、m/z285.045 4 ［M-Hcatechin］-。根据对照品及文献［33］ 报道，推测其为原花青素A2，化合物13 ～14、19 的准分子离子峰均为m/z575.120 3 ［M-H］-，主要质谱裂解碎片一致，推测三者为同分异构体； B 型原花青素以化合物5 为例，其保留时间为5.85 min，在负离子模式下准分子离子峰为m/z577.314 1 ［M-H］-，碎片离子主要有C4-C8键断裂脱去一分子儿茶素289.071 9 ［M-H-catechin］-，再失去一分子C6H8O3得到碎片离子m/z161.033 2 ［M-H-C6H8O3］-，C环开环后，脱掉C2、C3失去一个间苯三酚单元形成碎片离子m/z451.103 8 ［M-H-C6H6O3］-、RAD 反应得到碎片离子425.089 4 ［M-H-C8H8O3］-及进一步脱水后得到碎片离子m/z407.075 7 ［M-H-C8H8O3-H2O］-，根据对照品及文献［33-36］ 报道比对，鉴定化合物5 为原花青素B 型二聚体类化合物原花青素B2，化合物1、3～5、8、10、20 的准分子离子峰均为m/z577.314 1 ［M-H］-，主要质谱裂解碎片一致，推测7 种化合物为同分异构体，其质谱及裂解途径见图4～6。

图4 原花青素A2 低能量通道（A）、高能量通道（B）质谱图

图5 原花青素B2 低能量通道（A）、高能量通道（B）质谱图

图6 原花青素A2、B2 裂解规律

三聚体以化合物6 为例，其保留时间为6.11 min，在负离子模式下准分子离子峰为m/z863.181 0 ［M-H］-，产生的碎片离子有m/z711.129 3 ［M-H-C6H5O2］-，继续失去一分子catechin 得到碎片离子m/z411.074 0 ［M-Hcatechin］-； 黄烷单元间的共价键断裂得到m/z289.071 9［catechin-H］-和m/z573.101 6 ［M-H-catechin］-，并失去一个小分子得到m/z451.103 8 ［M-H-C6H5O2］-，碎片离子m/z289.071 9 ［catechin-H］-失去一分子CO2得到m/z245.086 6 ［M-H-CO2］-。根据以上裂解方式结合文献［35］，鉴定化合物6 为肉桂鞣质D1或其异构体，分子式为C45H36O18。化合物6、9、11 ～12 的准分子离子峰均为m/z863.181 0 ［M-H］-，主要质谱裂解碎片一致，推测四者为同分异构体，其在负离子模式下的质谱及裂解方式见图7～8。

图7 肉桂肉质D1 或其异构体低能量通道（A）、高能量通道（B） 质谱图

化合物17 （tR＝7.58 min） 分子式为C22H18O10，在负离子模式下准分子离子峰均为m/z441.081 3 ［M-H］-，其裂解途径主要是酯键的断裂产生2 个碎片离子m/z271.068 0 ［M-H-Gallic acid］-、m/z169.020 5 ［M-Hcatechin］-，在质谱中出现的离子m/z169 是特征性离子，此离子的存在说明结构中有没食子酸根的存在，该裂解特征与文献［37］ 报道一致，根据对照品比对，鉴定化合物17 为表儿茶没食子酸酯，化合物18 与其均具有相同的分子离子峰，其二级质谱裂解碎片一致，推测二者为同分异构体，推测其为儿茶没食子酸酯。其质谱及裂解途径见图9～10。

图9 表儿茶没食子酸酯的低能量通道（A）、高能量通道（B） 质谱图

图10 表儿茶没食子酸酯裂解规律

3.2.2 黄酮苷类化合物 黄酮类化合物广泛存在于自然界，是一类基本母核为2-苯基色原酮的化合物，大部分以游离形式、与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在。由于黄酮类化合物具有相同的母核，该类化合物有相似的裂解规律［38］。在血人参中共鉴定出4 个黄酮苷类化合物，质谱裂解规律主要表现丢失其糖基而得到苷元的离子峰，因此化合物15～16、21 ～22 被鉴定为黄酮苷类成分，其中化合物21～22 经对照品比对及文献［39-40］ 报道，分别鉴定为柚皮素-7-O-葡萄糖苷（21）、根皮苷（22），而化合物15～16 表现为与柚皮素-7-O-葡萄糖苷一样的质谱裂解规律，因此鉴定为柚皮素-7-O-葡萄糖苷同分异构体，分别为柚皮素-5-O-葡萄糖苷或其异构体、柚皮素-4＇-O-葡萄糖苷或其异构体。其质谱及裂解规律见图11～12。

图11 根皮苷低能量通道（A）、高能量通道（B） 质谱图

图12 根皮苷裂解规律

3.2.3 化合物对H2O2诱导HepG2 细胞损伤的保护作用400 μmol/L H2O2作用于HepG2 细胞12 h 后，对人肝细胞产生显著损伤，细胞存活率低于空白对照组（P＜0.01）；原花青素B2对H2O2导致的HepG2 细胞损伤有保护作用，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）； 阳性对照药（GSH） 亦表现显著肝细胞损伤保护活性（P＜0.05），见表2。

表2 各化合物对H2O2 诱导HepG2 细胞损伤的保护作用（±s）

表2 各化合物对H2O2 诱导HepG2 细胞损伤的保护作用（±s）

注： 与空白对照组比较，**P＜0.01； 与H2O2 比较，＃P＜0.05。

化合物浓度/（μmol·L-1）OD 值存活率/%空白对照组—0.852±0.022100.00 H2O2—0.638±0.061** 74.82 GSH200.740±0.014＃ 86.79原花青素B1100.703±0.05082.52儿茶素100.670±0.03778.63原花青素B3100.698±0.02881.91原花青素B2100.754±0.025＃ 88.48表儿茶素100.588±0.05569.01原花青素A1100.621±0.02872.85表儿茶素没食子酸酯100.710±0.02683.37原花青素A2100.649±0.06276.16槲皮素-7-O-葡萄糖苷100.675±0.03179.20根皮苷100.681±0.03779.87

3.2.4 化合物对油酸诱导HepG2 细胞损伤的保护作用240 μmol/L 油酸作用于HepG2 细胞24 h 后，细胞内形成显著的脂质沉积，脂滴含量升高（P＜0.01）； 根皮苷对油酸诱导的HepG2 细胞脂质沉积呈现抑制活性，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）； 阳性对照药（非诺贝特）对油酸诱导的HepG2 细胞脂质沉积也表现出显著的抑制作用（P＜0.05），见表3。

表3 各化合物对油酸诱导HepG2 细胞脂质沉积的保护作用（±s）

表3 各化合物对油酸诱导HepG2 细胞脂质沉积的保护作用（±s）

注： 与空白对照组比较，**P＜0.01； 与油酸比较，＃P＜0.05。

化合物浓度/（μmol·L-1）OD 值抑制率/%空白对照组—0.209±0.019—油酸—0.371±0.046**—非诺贝特200.309±0.021＃ 16.63原花青素B1100.384±0.033-3.58儿茶素100.373±0.027-0.45原花青素B3100.400±0.038-7.86原花青素B2100.342±0.0377.89表儿茶素100.347±0.0386.59原花青素A1100.363±0.0292.11表儿茶素没食子酸酯100.374±0.032-0.88原花青素A2100.360±0.0312.89槲皮素-7-O-葡萄糖苷100.370±0.0170.39根皮苷100.258±0.058＃ 30.51

4 讨论

本实验在负离子模式下，采用UPLC-Q-TOF-MS 技术对血人参中的化学成分进行了系统分析，根据信号峰的保留时间、质谱图信息、精确相对分子质量信息及分子式，结合对照品，利用UNIFY 软件及参考文献共鉴定出22 个主要信号峰的成分，并总结了它们的裂解规律。其中化合物8、10～12、14～16、20、22 首次在血人参中发现。该方法具有快速、准确等特点，可对多种类型化合物进行定性鉴别，同时也进一步为血人参的药效物质基础研究、饮片炮制工艺研究及体内外成分分析研究提供参考依据。此外，由于原花青素二聚体和三聚体上羟基的链接位置不同，导致该类成分中的同分异构体较多，上述裂解规律也为原花青素二聚体和三聚体成分的结构鉴定提供了重要依据，为今后原花青素类和黄酮苷的研究奠定了基础，为中药天然产物的鉴定提供了方法参考。本研究通过体外实验发现，原花青素B2对H2O2导致的HepG2 细胞损伤具有保护作用，根据文献报道，原花青素B2可提高肝细胞增殖活力，其保肝作用机制可能调控修复基因HOGG1 表达有关［41-43］； 根皮苷对油酸诱导的人肝细胞脂质沉积表现显著抑制活性，这与文献［25-44］ 报道一致，其体外保肝作用可能与提高脂肪氧化代谢基因的表达和降低胆固醇合成相关基因的表达有关。本研究结果为血人参的进一步利用开发提供科学的理论依据。