金银花对RNA病毒蛋白酶活性的影响

杨欣,危英,李星

(1.贵州中医药大学基础医学院,贵阳 550025; 2.贵州中医药大学药学院,贵阳 550025; 3.贵州百灵制药股份有限责任公司,安顺 550001)

中国自发生新型冠状病毒肺炎后,全国各地提出了新冠肺炎防治的中药处方,金银花是其中使用频次较高的中药之一[1]。金银花为忍冬科(Caprifoliaceae) 植物忍冬的带初开的花或干燥花蕾。具有清热解毒、疏散风热的功效,广泛用于喉痹、痈肿疔疮、丹毒、风热感冒、温病发热等,分布广泛,如贵州、河南、山东等地。主要化学成分有挥发油类、环烯醚萜苷类、黄酮类、有机酸类、三萜皂苷类及其他类成分。临床上常用于呼吸道及肺炎、皮肤疾病等疾病的治疗[2]。

蛋白酶的异常表达和活化与疾病有关,利用抑制剂抑制蛋白酶的活性可达到治疗相关疾病的目的,组织蛋白酶L(Cathepsin L,CTSL)具有木瓜蛋白酶家族的氨基酸序列,以酶原的形式贮存于溶酶体中,是一种有效的内肽酶,与溶酶体蛋白的降解有关[3]。该酶参与多种生物学和疾病发生发展过程,通过激活新型冠状病毒的刺突蛋白,在病毒入侵过程中起着重要的作用,是筛选抗新型冠状病毒药物的重要靶点[4]。人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)蛋白酶是HIV病毒全基因编码,裂解HIV病毒的前体多肽,公认为筛选抗HIV-1药物的重要靶点[5]。虽然冠状病毒的编码与人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus,HIV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)蛋白酶的酶分类不同,但是临床研究结果显示一些HIV蛋白酶抑制剂,如奈非那韦(Nelfifinavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、达芦那韦(Darunavir)等能显著抑制病毒的复制,加强病毒感染后药物的治疗效果。

现通过分子对接结合实验验证分析金银花与HIV-1和CTSL蛋白酶的结合情况,主要基于荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 技术分析金银花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物抑制HIV-1和CTSL蛋白酶的活性,为抗病毒药物的开发及应用提供理论依据。

1 材料

1.1 药材

2019年5月金银花药材采自贵州省安顺市,由贵州中医药大学陈德媛教授(生药学专家)鉴定为金银花(LonicerajaponicaThunb.),植物标本存放在贵州中医药大学科研楼322(标本号为LJ2019.04)。

1.2 试剂

100%甲醇(分析纯,北京索莱宝科技有限公司);SensoLyte© 520 HIV-1试剂盒Fluorimetric (AS-71147),SensoLyte© 520 Cathepsin L试剂盒Fluorimetric (AS-72218) 购于美国圣何塞 AnaSpec。

1.3 仪器及软件

旋转蒸发仪(N-1100D-WD,日本东京理化公司),电子分析天平(MS205DU,梅特勒托利多公司),酶标仪(Synergy II,美国伯腾公司),384孔板(批号:31018008,康宁公司),DMSO(D8370,索莱宝公司),Mili-Q系统超纯水(Advantage A10,美国密理博公司),SYBYL (2.1.1,美国Tripos公司)

2 方法

2.1 金银花活性成分筛选

金银花的化学成分基于中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)筛选。TCMSP平台收录的中药种类繁多,中药成分信息主要来自文献挖掘和数据库整合,针对每味中药,在互联网上查找了与其相关的已发表的文献和书籍,并参考了 TCM@taiwan、TCMD、TCMID等多个中药成分数据库,获取到每味中药的可靠的成分信息,可以下载化合物的三维结构。

设置TCMSP相关指标:分子量(molecular weight,MW)、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、类药性(drug likeness,DL)筛选金银花化学成分[6]。基于TCMSP在Herb name中查找金银花的化学成分。相关参数设置为:OB≥30%,DL≥0.18,MW≤500,保存为mol2格式。

2.2 受体和配体文件准备

从蛋白质晶体结构数据库RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 获取CTSL(PDB ID:3OF9)和HIV-1蛋白酶(PDB ID:1QBS)。利用 SYBYL 2.1.1 对蛋白晶体结构进行抽离配体、删除水分子、加氢、修复侧链氨基酸、加电荷、提取配体等前处理,保存备用;运用 SYBYL 2.1.1 构建金银花配体库并完成分子优化,设置参数:选择 GasteigerHückel 电荷,采用 Tripos 力场,最大迭代系数设置为10 000,其他参数均设为默认值,优化后保存备用。

2.3 分子对接分析

采用 SYBYL 2.1.1中的 Surflex-Docking 模块探究蛋白结合口袋中的配体-受体相互作用。Surflex-Dock是SYBYL软件中的分子对接模块,它采用独特的经验打分函数和基于分子相似性的搜索引擎,将配体分子对接至蛋白的结合位点[7]。Surflex-Dock使用原型分子(protomol)表示蛋白的结合口袋,利用探针探测蛋白口袋表面疏水、氢键和静电等性质,生成蛋白质活性口袋的负像。结果以总分值(T_Score)为阈值进行分析,其综合考虑了极性、疏水、溶剂化等作用,数值越大说明小分子和大分子相互作用力越好。运用 Ligplot1.4.5软件对结合好的蛋白复合物相互作用力进行分析,证实氢键在对接中起着重要的作用。

2.4 化学成分—靶点网络模型

基于Cytoscape 3.6.1 (https://cytoscape.org/download.html)构建化学成分-靶点网络模型,Cytoscape 的核心是网络,包括节点(node)和边(edge),每个节点可以是基因或蛋白质等;节点与节点之间的连接 (edge) 代表着这些节点之间的相互作用。

2.5 金银花不同溶剂提取物的制备

新鲜金银花置于45 ℃烘箱中烘干,并用药材粉碎机打磨成粉末。分别取25 g药材,粉碎,置于4个圆底烧瓶中,烧瓶中分别加入蒸馏水、30%甲醇、60%甲醇、85%甲醇各200 mL、超声2 min后,加热回流提取3次,第一、二次回流提取1 h,第3次回流0.5 h,合并提取液,减压浓缩成浸膏,真空干燥,分别得水提取、30%醇提物、60%醇提物和85%的醇提物。

2.6 荧光法验证金银花不同溶剂提取物抗RNA病毒蛋白酶的活性

根据文献[8]的试验方法,使用CTSL 和 HIV 蛋白酶试剂盒评价金银花不同溶剂提取物的活性。按照HIV-1蛋白酶试剂盒说明书进行操作,8 μL 重组 HIV-1蛋白酶加入 2 μL 金银花不同溶剂提取物,加入 10 μL HIV-1 蛋白酶底物启动反应,反应混合物在37 ℃卵孵 30 min ;按照CTSL试剂盒说明书进行操作,2 μL 金银花不同溶剂提取物 和 8 μL 人重组组织蛋白酶加入384孔板,在室温下预先暖孵10 min,每孔加入10 μL 新鲜组织蛋白酶底物溶液启动反应。反应混合物在37 ℃卵孵 30 min。每个样本测试三次,分别在490 nm和520 nm下检测样本的荧光值。

2.7 数据处理与分析

3 实验结果

3.1 金银花小分子配体库

筛选金银花21个活性成分,21活性成分有较好的口服吸收利用度,类药性和分子量符合前面筛选的要求(表1),基于SYBYL优化后保存SDF格式,用于后面的分子对接分析。绿原酸的口服吸收利用度为11.93%,虽然没有达到30%,但是绿原酸是最为重要的清热解毒活性物质,将纳入研究。

表1 金银花化学成分筛选

3.2 受体和配体优化

3.2.1 配体优化

基于SYBYL对金银花活性成分进行优化,图1为未优化的活性成分3D结构,对小分子配体进行基于Tripos力场的能量最小化计算,优化分子结构,获得合理构象(图2)。

图1 金银花优化前的3D分子结构

图2 金银花优化后的3D分子结构

3.2.2 受体优化

基于PDB数据库下载CTSL蛋白酶结构,通过SYBYL去水、加全氢、加电子,选择Ligand(A/IOX5O1)模式形成口袋(图3);基于PDB数据库下载HIV-1蛋白酶结构,选择Ligand(A/DMP323)模式形成口袋,如图4所示。

图3 组织蛋白酶L的蛋白结构及结合口袋

图4 HIV-1蛋白酶的蛋白结构及结合口袋

3.3 分子对接分析

金银花与HIV-1和CTSL蛋白酶分子对接结果得到T_Score、Crash和Polar 等参数值为对接成功,按默认参数进行分子对接后,每个小分子输出20种构象(表2)。阳性对照药Pepstatin A(22)与HIV-1 蛋白酶的T_Score为 10.2,说Pepstatin A与HIV-1 蛋白酶结合能力较好。金银花20个活性成分与HIV-1 蛋白酶有较好的结合(T_Score >5),11个化学成分有强烈的结合(T_Score >7),其中六氢番茄红素与HIV-1 蛋白酶结合最好,图5是六氢番茄红素与HIV-1 蛋白酶结合口袋;阳性对照药Cathpsin L 抑制剂(23)与CTSL蛋白酶的T_Score值为 8.5,说明Cathpsin L抑制剂与CTSL结合能力较好。金银花中9个活性成分与CTSL活性有较好的结合(T_Score >5),3个活性成分有强烈的结合(T_Score >7),其中Mandenol 与CTSL结合最好,图6是Mandenol 与CTSL结合口袋。运用 Ligplot1.4.5软件对结合好的蛋白复合物相互作用力进行分析,发现金银花化学成分与HIV-1和CTSL蛋白酶分别形成46个和10个氢键。

图5 六氢番茄红素与HIV-1蛋白酶结合口袋

图6 Mandenol与CTSL结合口袋

表2 分子对接结果分析

3.4 化学成分-靶点网络模型

基于Cytoscape软件构建了化学成分—靶点网络模型,HIV-1 蛋白酶和CTSL为靶节点(target node),节点的连通度越高,节点越大,实验结果发现金银花抗HIV-1蛋白酶和CTSL的作用具有整体性,9个化学成分能同时影响HIV-1 蛋白酶和CTSL的活性(表3),将采用实验研究验证分子对接的结果。

表3 化学成分-靶点网络分析

3.5 金银花不同溶剂提取物抗HIV-1和组织蛋白酶L活性

从分子对接分析发现金银花整体抗HIV-1蛋白酶的作用可能比CTSL作用要强,制备金银花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物,为了有效地证实分子对接筛选结果,明确金银花不同提取工艺制备的制剂,其药效的差异性,为后面深入研究提供理论依据。通过荧光法分析发现金银花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物具有抗HIV-1的活性。金银花水提物、30%、60%、85% 醇提物半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值依次为0.147、0.015、0.05、0.121 mg/mL(表4)。通过荧光法分析发现金银花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物、85% 醇提物没有强烈的抗组织蛋白酶L的活性(表4),也充分证明了分子对接筛选的结果。

表4 金银花不同溶剂提取物抗HIV-1蛋白酶和CTSL活性(n=3)

4 讨论

金银花从古至今被誉为清热解毒的良药,能宣风散热,还可清热解毒。目前,在食品行业有较多的金银花产品,如金银花糖、金银花饮料、金银花茶等,受到人们的喜爱。同时,金银花抗菌、降血脂、抗炎、降血糖及免疫调节等生物活性表现出独特的应用价值,具有较好的应用前景[10]。已经有多项研究表明金银花在抗病方面有较大的优势,如金银花提取物中的氯原酸银花对呼吸道病毒(合胞病毒和柯萨奇)有明显的抑制作用[11];王变利等[12]研究表明金银花水提取对甲型流感病毒 H1N1 株有明显抑制作用;贾伟等[13]研究表明金银花多糖具有良好的抗甲型流感病毒的作用,能延长小鼠的存活时间,降低病毒感染小鼠的死亡率,减轻肺病变程度;王剑等[14]研究表明金银花多糖抑制单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒 B3、柯萨奇病毒 B5等多种病毒;汪晓露等[15]研究表明中药金银花被广泛运用在 COVID-19 治疗中,如金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、热毒宁注射液、双黄连口服液等以金银花为组成的中成药被推荐在多个 COVID-19 诊疗方案中。

金银花的功能性成分主要有黄酮类、有机酸、挥发油、三萜皂苷类等。金银花中最早分离得到的金银花黄酮类化合物是木犀草素[16];有机酸类如绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、棕榈酸等,绿原酸是最为重要的清热解毒活性物质,有机酸类成分是金银花清热解毒的物质基础。对基于TCMSP金银花的化学成分进行筛选,这个数据库的化学成分信息主要来自文献挖掘和数据库整合,针对每味中药,在互联网上查找了与其相关的已发表的文献和书籍,并参考了 TCM@taiwan、TCMD、TCMID 等多个中药成分数据库,获取到每味中药的可靠的成分信息[17]。通过分子对接及实验验证分析发现金银花具有抗HIV-1的活性,尚未发现有强烈抑制组织蛋白酶L的活性。蛋白酶的异常表达和活化与疾病有关,CTSL 已被公认为是筛选抗新型冠状病毒药物的重要靶点,在病毒入侵过程中扮演着重要的作用。临床研究结果显示一些HIV蛋白酶抑制剂已显著抑制新冠病毒的复制,提升新冠病毒感染后药物治疗效果。

本文研究的验证实验主要基于荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 技术,其是比较早发展起来的一门技术,是一种能实现完全自动化激酶活性检测方法。这种方法主要将“供体”和“受体”荧光分子连接在一起,如果“供体”光分子受到激发时,能将非放射性的能量转移到“受体”荧光分子上,并发生荧光信号[18-19]。通过荧光法分析发现金银花水提物、30%醇提物、60%醇提物和85%醇提物具有抗HIV-1的活性,与筛选的结果具有一致性。目前本文研究存在着一定的局限性,如生理状态下蛋白酶结构的动态变化信息难以获得。因此,下一步本课题组将采用分子动力学模拟技术能够弥补这一不足,揭示蛋白酶构象动态变化的过程,获得其构象变化过程中的能量信息等。

5 结论

通过分子对接及实验验证分析发现金银花具有抗HIV-1的活性,尚未发现有强烈抑制组织蛋白酶L的活性。金银花抗HIV-1蛋白酶活性强于Cathepsin L蛋白酶。金银花水提物、30% 醇提物、60% 醇提物和85% 醇提物具有抗HIV-1的活性,其中30% 醇提物具有较好的抗HIV-1的作用。