LncRNA SNHG16靶向调控miR-516a-5p对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

杨丰帅 邱东达 杨运泉 龚双喜 陈石林 汪欣宇

长沙市第一医院胃肠外科（长沙 410005）

结直肠癌为消化道常见恶性肿瘤，临床发病率逐年升高，发病早期，患者无明显症状，多数患者确诊时已为晚期，可造成患者不良预后。结直肠癌临床发病机制复杂，故对其分子机制进行分析，寻找治疗结直肠癌新途径具有重要意义。临床研究显示，在结直肠癌发展过程中，LncRNA、miRNAs可作为促癌、抑癌基因，对细胞的增殖、侵袭、凋亡进行调控［1］。lncRNA可对基因的转录进行调节，在肿瘤的发生、发展中作用较为重要，lncRNA SNHG16可促进多种肿瘤发展，且与肿瘤的分期、耐药具有一定相关性，可对机体内相关信号通路进行调节［2］。miR-516a-5p在肝癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤中表达下降，可对多种蛋白进行调节，进而控制细胞的增殖、迁移［3］。临床研究中，暂未有研究显示lncRNA SNHG16可靶向调控miR-516a-5p对结直肠癌细胞的增殖、迁移进行调节，基于此，本研究分析干扰lncRNA SNHG16调控miR-516a-5p对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂人结直肠癌细胞系（HCT116、SW620、SW480）购自于上海抚生实业有限公司，结直肠上皮细胞FHC购自上海澳音生物科技有限公司。DMEM完全培养液（北京信生元生物医学科技有限公司）；培养箱（杭州诺丁科学器材有限公司）；电化学发光试剂盒（上海联硕生物科技有限公司）；全蛋白提取试剂盒（昆山远慕生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒（武汉益普生物科技有限公司）；四甲基联苯胺（TMB）溶液（上海化邦生物科技有限公司）；pcDNA、lncRNA SNHG16、anti-miR-NC、anti-miRNA-516a-5p、si-NC、si-SNHG16、miRNC、miRNA-516a-5p购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；CyclinD1、MMP-2、MMP-9、GADTH抗体购自上海延慕实业有限公司。

1.2 标本来源选取2022年3月至2023年3月在医院进行手术治疗的20例结直肠癌患者，取患者结直肠癌组织、癌旁组织，该研究经患者、家属知情同意，经我院伦理委员会审核批准。

1.3 细胞培养将FHC、HCT116、SW620、SW480细胞，均置于含1%双抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中予以培养，此培养基内含10%的灭活的FBS，在CO25% 37 ℃的培养箱内予以培育，当细胞的融合度至80%时，选取胰蛋白酶（0.25%）对细胞进行消化，后对其实施传代培育，选用3次以上传代的对数生长期的细胞予以后续的试验。

1.4 细胞转染取SW480细胞，作为NC组，对SW480细胞转染si-NC，作为si-NC组，对SW480细胞做SNHG16抑制剂转染，作为si-SNHG16组，miR-NC组为SW480细胞转染miR-NC，miR-516a-5p组为SW480细胞转染miR-516a-5p模拟物，si-SNHG16+anti-miR-NC组为SW480细胞做SNHG16抑制剂转染+anti-miR-NC，si-SNHG16+anti-miR-516a-5p组SW480细胞做SNHG16抑制剂转染+miR-516a-5p抑制剂，分组后，继续对细胞培养，细胞融合度为80%后，进行转染，连续转染24 h。

1.5 检测方法

1.5.1 lncRNA SNHG16、miR-516a-5p表达水平检测提取癌组织、癌旁组织，放入液氮中研磨，根据试剂盒说明书提取总RNA，后转录为cDNA，采用RT-PCR对lncRNA SNHG16、miR-516a-5p表达量进行鉴定，反应条件：95 ℃预变性3 min、95 ℃变性5 s、56 ℃退火10 s，72 ℃ 25，进行40个循环，72 ℃ 10 min，采用2-△△Ct方法计算出lncRNA SNHG16、miR-516a-5p的表达量。引物序列见表1。

1.5.2 细胞增殖检测采用MTT比色法对细胞的增殖情况进行检测，对细胞的浓度进行调整，后将其接种于96孔板，加入0.2 mL细胞悬液，在37 ℃、5% CO2环境中培养，分别于24、48、72 h在其中添加0.01 mL MTT试剂，孵育4 h，后采用酶标仪测定490 nm处细胞OD值，对细胞增殖率进行计算，试验重复进行5次，结果取平均值。

1.5.3 细胞凋亡检测细胞凋亡情况通过TUNEL法进行测定，将所培养细胞做洗涤、DAPI染色封片后的细胞核分别呈现为蓝色荧光（阴性细胞数）、绿色荧光（阳性细胞数），之后细胞凋亡情况采用荧光显微镜进行观察，细胞凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。试验重复测量3次。

1.5.4 细胞迁移情况检测细胞迁移能力通过进行划痕试验进行检测，选取SW480用胰蛋白酶分解，获取细胞悬液接种到6孔板上，所有单层细胞采用1.60 mL移液器枪头自上而下做一条划痕，刮下细胞用PBS缓冲液洗涤，向干净培养基中加入4 mL溶液，37 ℃下培育29 h，弃去培养液，在显微镜下观察并记录视野平均值，重复3次，取细胞迁移数平均值。

1.5.5 细胞侵袭能力检测细胞侵袭能力通过Transwell实验进行检测，在Transwell小室铺基质胶，24孔板中加入600 μL 10%胎牛血清培养基，上室分别接种100 μL各组细胞悬液，37 ℃、5%CO2培养箱培养18 h。滤膜用4%多聚甲醛固定20 min。棉签擦去滤膜表面细胞，结晶紫染色，光镜下随机选5个视野，计算细胞总数，以穿过Matrigel基质胶的细胞数来表示SW480的侵袭能力。循环3次，计算出SW480侵袭数总均值。

1.5.6 CyclinD1、MMP-2、MMP-9检测采用Western Blot法检测，将培养的SW480细胞放入离心管，将RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂加入，以12 000 r/min离心处理10 min，制作组织匀浆，取上层清液，使用BCA法对蛋白浓度测定，后取相同质量蛋白，放入10% SDS-PAGE凝胶中，进行电泳、转膜处理，后采用5%脱脂奶粉进行封管处理，放入4 ℃冰箱中，过夜处理，后进行清洗。加入CyclinD1、MMP-2、MMP-9抗体，孵育2 h，进行清洗，加入HRP标记二抗，室温下孵育3 h，凝胶成像系统下观察成像情况，计算恢复值，以GAPDH为内参，对蛋白表达情况分析。

1.5.7 双荧光素酶报告试验采用starBase网站对预测lncRNA SNHG16表靶基因，结果显示，lncRNA SNHG16中含有与miR-516a-5p互补核苷酸序列，包括WT-lncRNA SNHG16、MUT-lncRNA SNHG16，将WT-lncRNA SNHG16、MUT-lncRNA SNHG16、miR-NC、miR-516a-5p转入SW480细胞，进行双荧光素酶检测。试验重复进行5次，结果取平均值。

1.6 统计学方法采用SPSS 26.0软件分析，计量资料采用均值±标准误表示，符合正态分布的两组间比较采用t检验，多组间进行比较采用F检验，计数资料以率（%）表示，P＜ 0.05表示其差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA SNHG16、miR-516a-5p在结直肠癌组织中的表达与癌旁组织相比，结直肠癌组织中lncRNA SNHG16表达水平升高，miR-516a-5p表达水平降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 LncRNA SNHG16、miR-516a-5p在结直肠癌组织中的表达Tab.2 Expression of LncRNA SNHG16，miR-516a-5p in colorectal cancer tissues ±s

表2 LncRNA SNHG16、miR-516a-5p在结直肠癌组织中的表达Tab.2 Expression of LncRNA SNHG16，miR-516a-5p in colorectal cancer tissues ±s

组别癌旁组织结直肠癌组织t值P值SNHG16 1.00 ± 0.21 3.58 ± 0.42 17.375 0.001 miR-516a-5p 1.00 ± 0.36 0.45 ± 0.05 4.785 0.001

2.2 结直肠癌细胞系中LncRNA SNHG16、miR-516a-5p表达水平与FHC组相比，HCT116组、SW620组、SW480组细胞中lncRNA SNHG16表达水平升高，miR-516a-5p表达水平较低，且SW480组lncRNA SNHG16水平最高、miR-516a-5p水平最低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表3。

表3 结直肠癌细胞系中LncRNA SNHG16、miR-516a-5p表达水平Tab.3 Expression levels of LncRNA SNHG16 and miR-516a-5p in colorectal cancer cell lines ±s

表3 结直肠癌细胞系中LncRNA SNHG16、miR-516a-5p表达水平Tab.3 Expression levels of LncRNA SNHG16 and miR-516a-5p in colorectal cancer cell lines ±s

组别FHC组HCT116组SW620组SW480组F值P值SNHG16 1.00 ± 0.18 4.92 ± 0.58 4.94 ± 0.59 5.14 ± 0.61 20.585 0.001 miR-516a-5p 1.00 ± 0.27 0.49 ± 0.06 0.44 ± 0.05 0.41 ± 0.04 6.836 0.001

2.3 干扰lncRNA SNHG16表达对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响与NC组相比，si-NC组SNHG16、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、凋亡细胞、迁移细胞数、侵袭细胞数变化较小，差异无统计意义（P＞ 0.05）。与si-NC组相比，si-SNHG16组lncRNA SNHG16表达水平降低（P＜ 0.05），表明干扰lncRNA SNHG16表达的SW480细胞株构建成功，与si-NC组相比，si-SNHG16组CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数降低，凋亡细胞升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表4、图1。

图1 Western blot蛋白图Fig.1 Western blot protein plot

表4 干扰lncRNA SNHG16表达对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响Tab.4 Effects of interfering lncRNA SNHG16 expression on proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

表4 干扰lncRNA SNHG16表达对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响Tab.4 Effects of interfering lncRNA SNHG16 expression on proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

组别SNHG16 CyclinD1 MMP-2 MMP-9迁移细胞数侵袭细胞数NC组si-NC组si-SNHG16组F值P值1.00 ± 0.15 1.04 ± 0.18 0.35 ± 0.42 4.609 0.001 0.95 ± 0.08 0.92 ± 0.07 0.52 ± 0.04 15.203 0.001 0.75 ± 0.08 0.77 ± 0.09 0.35 ± 0.04 14.142 0.001 0.81 ± 0.09 0.79 ± 0.08 0.29 ± 0.03 17.333 0.001 OD值（490 nm）24 h 0.46 ± 0.05 0.43 ± 0.04 0.22 ± 0.03 13.016 0.001 48 h 0.78 ± 0.08 0.77 ± 0.07 0.48 ± 0.06 9.487 0.001 72 h 1.19 ± 0.22 1.17 ± 0.20 0.64 ± 0.06 7.627 0.001凋亡细胞（%）7.25 ± 0.81 7.29 ± 0.82 23.25 ± 3.48 14.161 0.001 175.25 ± 23.14 177.32 ± 23.18 84.25 ± 9.25 11.548 0.001 132.36 ± 21.03 133.05 ± 21.06 48.25 ± 5.31 13.263 0.001

2.4 高表达miR-516a-5p对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响与NC组相比，miR-NC组SNHG16、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、凋亡细胞、迁移细胞数、侵袭细胞数变化较小，差异无统计意义（P＞ 0.05）。与miR-NC组相比，miR-516a-5p组miR-516a-5p表达水平升高（P＜ 0.05），表明高表达miR-516a-5p的SW480细胞株构建成功，与miR-NC组相比，miR-516a-5p组CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数降低，凋亡细胞升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表5、图2。

图2 Western blot蛋白图Fig.2 Western blot protein plot

表5 高表达miR-516a-5p对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响Tab.5 Effects of high expression of miR-516a-5p on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells x ± s

2.5 lncRNA SNHG16靶向调控miR-516a-5p表达双荧光素酶报告试验显示，与miR-NC组相比，miR-516a-5p可使SNHG16荧光素酶活性降低（P＜ 0.05），对MUT-SNHG16荧光素酶活性影响较小（P＞ 0.05），见表6。

表6 双荧光素酶报告试验Tab.6 Dual-luciferase reporter assay ±s

表6 双荧光素酶报告试验Tab.6 Dual-luciferase reporter assay ±s

组别miR-NC组miR-516a-5p组t值P值WT-SNHG16 1.03 ± 0.14 0.49 ± 0.05 11.487 0.001 MUT-SNHG16 1.02 ± 0.12 1.00 ± 0.10 0.405 0.690

2.6 沉默miR-516a-5p表达逆转干扰lncRNA SNHG16对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响与si-NC组相比，抑制lncRNA SNHG16表达可使SW480细胞中miR-516a-5p表达、凋亡细胞升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数降低（P＜ 0.05），与si-SNHG16+antimiR-NC组相比，si-SNHG16+anti-miR-516a-5p组miR-516a-5p表达、凋亡细胞降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表7、图3。

图3 Western blot蛋白图Fig.3 Western blot protein plot

表7 沉默miR-516a-5p表达逆转干扰lncRNA SNHG16对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响Tab.7 Silencing of miR-516a-5p expression reversed the effects of interfering lncRNA SNHG16 on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

表7 沉默miR-516a-5p表达逆转干扰lncRNA SNHG16对SW480细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响Tab.7 Silencing of miR-516a-5p expression reversed the effects of interfering lncRNA SNHG16 on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

组别miR-516a-5p CyclinD1 MMP-2 MMP-9迁移细胞数侵袭细胞数si-NC组si-SNHG16组si-SNHG16+anti-miR-NC组si-SNHG16+anti-miR-516a-5p组F 值P 值0.38 ± 0.04 1.06 ± 0.21 1.04 ± 0.20 0.45 ± 0.06 8.935 0.001 0.92 ± 0.07 0.52 ± 0.04 0.50 ± 0.03 0.94 ± 0.08 16.285 0.001 0.79 ± 0.08 0.31 ± 0.04 0.30 ± 0.03 0.81 ± 0.09 17.000 0.001 0.80 ± 0.09 0.27 ± 0.03 0.31 ± 0.04 0.75 ± 0.08 15.556 0.001 OD值（490 nm）24 h 0.44 ± 0.05 0.20 ± 0.03 0.23 ± 0.04 0.46 ± 0.06 10.086 0.001 48 h 0.81 ± 0.09 0.51 ± 0.06 0.50 ± 0.05 0.77 ± 0.08 9.050 0.001 72 h 1.19 ± 0.20 0.72 ± 0.08 0.75 ± 0.09 1.23 ± 0.21 6.645 0.001凋亡细胞（%）7.34 ± 0.85 21.58 ± 3.47 20.66 ± 3.34 7.49 ± 0.87 12.067 0.001 170.36 ± 22.03 80.36 ± 9.01 79.18 ± 8.93 166.52 ± 21.18 12.016 0.001 142.36 ± 22.14 50.36 ± 6.03 48.36 ± 5.85 138.36 ± 21.11 12.992 0.001

3 讨论

临床多采用手术联合化疗对结直肠癌患者治疗，但该治疗方式预后较差，故寻找结直肠癌的新型治疗靶点，对结直肠癌早期筛查具有重要意义。

临床研究表明［4］，多种细胞的分化、转移、增殖等生物学进程可受到lncRNA的影响，lncRNA为潜在的致癌基因，lncRNA表达升高，可使肿瘤细胞的发生、发展受到影响，为临床治疗恶性肿瘤的潜在靶点。SNHG16为致癌基因，表达升高后，可促进结直肠癌的进展、生长，在结直肠癌的临床病理学特征中，可对细胞的凋亡、转移、侵袭进行调控［5］。lncRNA SNHG16为小核仁RNA宿主基因中的成员，为致癌RNA，在多种恶性肿瘤中具有较高的表达水平，并可影响肿瘤患者预后［6］。有关研究显示［7］，lncRNA SNHG16在肝癌组织、细胞中表达升高，抑制其表达，可使肝癌细胞的迁移、增殖、侵袭减缓，且检测lncRNA SNHG16表达，可用于预测肝癌患者的总生存期。lncRNA SNHG16表达升高，可影响脂质代谢的相关基因，使胃癌细胞的增殖速度加快，促进其迁移、侵袭［8］。有研究显示，lncRNA SNHG16高表达于结直肠癌患者，抑制lncRNA SNHG16表达，可使细胞的凋亡速度加快，并抑制其转移，使肿瘤细胞的存活率下降［9］。本文研究显示，干扰lncRNA SNHG16表达，可使CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值表达降低，并促进细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的转移、侵袭，该研究与上述研究一致，表明lncRNA SNHG16具有致癌作用，干扰lncRNA SNHG16表达，可降低细胞的增殖、转移能力，促使其恢复。

miRNA为调控性小RNA，在多种疾病中表达水平处于异常状态，可参与多种疾病发生、发展，miRNA具有调节基因降解的作用，可对基因的翻译进行抑制，并调节基因的衰减，影响其他miRNA表达，且miRNA可对炎症介质的释放、免疫细胞的分化进行调节［10］。在非小细胞肺癌中，miR-516a-5p具有抑癌作用，具有利于非小细胞肺癌存活的作用，miR-516a-5p低表达于结直肠癌组织，可影响结直肠癌细胞的增殖、转移，为结直肠癌的抑制因子［11］。研究显示［12］，lncRNA SNHG16通过与不同miRNA分子结合对肿瘤的进展进行调控，lncRNA SNHG16可介导miR-877-5p/FOXP4轴，使喉鳞状细胞癌细胞的增殖速度加快，促进喉鳞状细胞癌的发展，敲减lncRNA SNHG16表达，升高miR-342-3p表达，使多发性骨髓瘤细胞的凋亡速度加快，抑制肿瘤的发展，且lncRNA SNHG16可下调DKK3表达，使胃癌上皮-间质转化速度加快。细胞转移能力的增加与肿瘤的进展具有一定相关性，CyclinD1为肿瘤启动子，MMP-2、MMP-9为基质金属蛋白酶，可使细胞外基质的沉积发生降解，促进细胞的迁移、侵袭。本研究显示，miR-516a-5p在结直肠癌中表达下降，lncRNA SNHG16表达升高，两者呈负相关，敲减lncRNA SNHG16表达，可使miR-516a-5p激活，抑制结直肠癌细胞的转移、侵袭，并降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达，表明干扰lncRNA SNHG16表达，可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移，促进其凋亡，是荧光素酶报告显示，lncRNA SNHG16对miR-516a-5p具有负调控作用。本研究显示，miR-516a-5p表达降低，可逆转干扰lncRNA SNHG16对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用，使CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达升高，表明在结直肠癌中，lncRNA SNHG16起miR-516a-5p海绵作用，可对结直肠癌的生物学进程进行调节。

综上所述，lncRNA SNHG16在结直肠癌中表达升高，miR-516a-5p表达降低，抑制lncRNA SNHG16表达，可使miR-516a-5p表达升高，增加细胞凋亡率升高，并抑制其增殖、迁移、侵袭，表明lncRNA SNHG16可靶向调控miR-516a-5p，使结直肠癌细胞的增殖减缓，抑制结直肠癌的发展，具有较好治疗效果，可成为结直肠癌的治疗靶点。本研究在研究过程中也具有相对局限性，未进行动物体试验，且未进一步验证miR-516a-5p对结直肠癌细胞的增殖、凋亡的影响，后续应建立动物试验模型，进一步研究。