慢性乙型病毒性肝炎病人血浆中LncRNA PVT1、微RNA-31-5p表达水平与炎症损伤程度的相关性分析

黎绍球，殷思纯，林沛基

作者单位：东莞市人民医院感染科，广东 东莞523000

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球公共卫生关注的主要问题之一，可导致急性或慢性乙型肝炎（CHB）［1-2］。据估计，中国每年约有7 000万慢性乙肝表面抗原携带者（流行率5%～6%）［3］。为减轻HBV感染的负担，肝脏炎症和纤维化的早期准确诊断至关重要。人浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1）是近年发现的和炎症相关的长链非编码RNA。研究表明长链非编码RNA（LncRNA） PVT1在脓毒症及肺损伤发生的炎症反应中起重要作用［4-5］。朱怡卿［6］研究表明LncRNA PVT1高表达可能是诊断肝癌的潜在生物指标。推测LncRNA PVT1的表达异常可能也与CHB有关。研究表明循环miRNA的水平与包括病毒性肝炎在内的多种疾病有关［7］。微RNA-31-5p（miR-31-5p）在多种组织和细胞中表达，已有报道发现其在不同类型的肿瘤中发挥不同作用［8］，但与乙型肝炎病毒的关系还未见报道。有研究表明，LncRNA PVT1存在可与miR-31靶向结合的位点［9］。基于此，本研究旨在通过检测CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p的表达情况，探讨其在CHB中的作用及与炎症损伤程度的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取东莞市人民医院2019年12月至2020年12月确诊为CHB病人180例为CHB组，所有病人均行肝穿刺活检，年龄范围24～65岁，其中男性101例，女性79例，年龄（42.33±10.62）岁。根据炎症损伤程度［10］分为G1组（66例）、G2组（58例）、G3组（41例）、G4组（15例）。参照Scheuer分级标准对肝纤维化程度进行分期，无明显肝纤维化（S0，S1）组（64例），明显肝纤维化组（S2，S3）（78例），早期肝硬化（S4）组（38例）。纳入标准：①符合《慢性乙型病毒性肝炎防治指南（2015年更新版）》中CHB的诊断标准［11］；②病人或其近亲属签署知情同意书。排除标准：①在过去6个月内使用过抗病毒或免疫调节剂治疗；②女性妊娠试验阳性；③酒精性肝病；④有细菌感染的受试者；⑤有丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒合并感染者；⑥合并糖尿病、甲状腺功能障碍、自身免疫性疾病和心理问题。同时选取55例健康者为对照组，年龄范围28～55岁，其中男性30例，女性25例，年龄（43.24±10.35）岁。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 均采集空腹静脉血5 mL，放入离心机，采用10 000 r/min离心处理15 min后取血清置于-80 ℃保存备用。采用酶联免疫法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、IL-10、超敏C反应蛋白（Hs-CRP）等炎性因子浓度。采用生化分析仪器及配套试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、谷氨酰基转移酶（GGT）等生化指标的表达水平。

1.2.2 实时荧光定量PCR法检测血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p水平 使用TRIzol（Invitrogen）试剂提取总RNA并使用miRNeasy Mini Kit（Qiagen，美国）进行纯化。在NanoDrop2000分光光度计上检测RNA的浓度。取1 μg总RNA为模板进行反转录，获得互补DNA（cDNA）。以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR法检测LncRNA PVT1、miR-31-5p的表达水平。PCR反应体系为：2 μL cDNA模板，miS-cript SYBR®Green Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，无RNA酶的灭菌水3.0 μL。反应条件：先预变性95 ℃，10 min；然后以95 ℃变性10 s；60 ℃退火20 s；70 ℃延伸10 s的条件进行，共设40个循环。采用2-ΔΔCt法对血清LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平进行定量分析，参见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.3 统计学方法 利用SPSS 22.0进行统计学分析，计数资料采用例数表示，行χ2检验；若符合正态分布，采用进行统计描述，进行方差齐性检验，若方差齐，两组数据的组间比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，总体有差异进一步通过LSD法进行两两比较；采用Pearson法分析LncRNA PVT1、miR-31-5p表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料 对照组和CHB组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。CHB组病人TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、Hs-CRP、ALT、AST、GGT均显著高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 CHB病人180例与健康者55例一般资料比较

2.2 LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平 CHB病人血清中LncRNA PVT1表达水平高于对照组，且表达水平随着炎症损伤程度增加而升高（P＜0.05）。CHB病人血清中miR-31-5p表达水平低于对照组，且表达水平随着炎症损伤程度增加而降低（P＜0.05）。见表3。

表3 CHB病人180例与健康者55例血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平比较/

表3 CHB病人180例与健康者55例血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平比较/

注：CHB为慢性乙型病毒性肝炎，LncRNA PVT1为长链非编码RNA人浆细胞瘤转化迁移基因1，miR-31-5p为微RNA-31-5p。①与对照组比较，P＜0.05。②与G1组比较，P＜0.05。③与G2组比较，P＜0.05。④与G3组比较，P＜0.05。

例数55 66 58 41 15 LncRNA PVT1 0.68±0.23 1.52±0.31①1.93±0.47①②2.57±0.63①②③3.42±1.03①②③④166.14＜0.001组别对照组G1组G2组G3组G4组F值P值miR-31-5p 0.96±0.24 0.85±0.22①0.79±0.18①②0.63±0.14①②③0.50±0.11①②③④26.12＜0.001

2.3 不同纤维化程度病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平 不同纤维化程度的CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 不同纤维化程CHB度病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平比较/

表4 不同纤维化程CHB度病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平比较/

注：CHB为慢性乙型病毒性肝炎，LncRNA PVT1为长链非编码RNA人浆细胞瘤转化迁移基因1，miR-31-5p为微RNA-31-5p。

组别无明显肝纤维化组明显肝纤维化组早期肝硬化组F值P值例数64 78 38 LncRNA PVT1 1.99±0.65 2.04±0.68 2.16±0.72 0.76 0.47 miR-31-5p 0.79±0.23 0.74±0.19 0.70±0.18 2.48 0.086

2.4 LncRNA PVT1与miR-31-5p的相关性分析本研究中LncRNA PVT1、miR-31-5p数据正态性检验显著性均大于0.05，可直接进行Pearson相关性分析。分析结果显示，CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平呈明显负相关（r=-0.36，P＜0.05），见图1。

图1 慢性乙型病毒性肝炎病人血清中LncRNA PVT1与miR-31-5p表达的相关性分析

2.5 血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平与炎性因子的相关性分析 本研究中CHB病人血清中LncRNA PVT1、miR-31-5p及炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT、IL-10）数据正态性检验显著性均大于0.05，可直接进行Pearson相关性分析。结果表明miR-31-5p与TNF-α、IL-6、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT、IL-10呈负相关（P＜0.05），LncRNA PVT1与TNF-α、IL-6、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT、IL-10均呈正相关（P＜0.05）。见表5。

表5 LncRNA PVT1、miR-31-5p表达水平与炎性因子的相关性

3 讨论

CHB病毒感染是一种可能危及生命的肝脏疾病，具有严重的并发症，如肝硬化和肝细胞癌，严重威胁着病人的健康［12］。一般来说CHB的病变与炎症和纤维化有关。肝组织的炎症等级反映了肝损伤和肝炎激活的现状［13］。

LncRNA是一种大于200个核苷酸的RNA分子，不编码蛋白质，在细胞增殖、凋亡以及癌症进展过程等各个方面具有重要作用。据报道，位于8q24.21的LncRNA PVT1具有致炎和致癌的作用［14］。周芳等［15］研究表明LncRNA PVT1可通过上调miR-423-5p减轻支气管上皮细胞凋亡，抑制哮喘相关炎性因子分泌。在本研究中CHB病人血清中LncRNA PVT1表达水平高于对照组，且随着炎症损伤程度加重而升高，表明LncRNA PVT1与病人的炎症损伤程度密切相关，其表达上调可能加重炎症反应，可能作为预测CHB病人炎症损伤程度的血清学指标。进一步研究显示血清中LncRNA PVT1与TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT均呈正相关，表明发病过程中机体内发生剧烈的炎症反应，释放大量炎性因子，LncRNA PVT1可能通过影响或调节炎性因子的产生，并影响病人的肝功能，进而参与CHB的发生、发展过程，其具体机制有待进一步研究。

miRNAs是小的非编码RNA，通过与细胞信使RNA的相互作用在调节各种生物过程中发挥重要作用［16］。据报道，miRNAs已被应用于感染性疾病的诊断和预后的生物标志物，如人类结核病、脓毒症和病毒性肝炎［17］。CHBmiR-31是一种炎性相关微RNA，它的特异性表达与脊髓损伤、糖尿病肾病等疾病有关［18］。miR-31-5p是miR-31成员之一，研究表明miR-31-5p在结肠癌、口腔鳞癌以及前列腺癌等肿瘤中呈高表达［19］。Zhao等［20］发现，与正常肝细胞相比，miR-31-5p在肝细胞癌细胞系中下调。在本研究中CHB病人血清中miR-31-5p表达水平低于对照组，且随着炎症损伤程度加重而降低，表明miR-31-5p表达异常与CHB疾病的发生及体内炎症损伤程度密切相关。本研究通过Pearson法进行相关性分析，结果显示CHB病人血清中miR-31-5p表达水平和TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、Hs-CRP、ALT、AST、GGT均呈负相关，提示miR-31-5p可能通过影响机体内炎性因子指标及肝功能指标水平，影响炎症损伤程度，进一步影响疾病的发展进程。刘晶晶等［21］研究发现，卵巢癌组织中lncRNA PVT1、miR-31表达呈负相关，这与本研究结果相符。本研究CHB病人血清中LncRNA PVT1与miR-31-5p表达水平呈明显负相关，提示二者之间存在某种负反馈机制，共同作用于疾病的发生发展，二者之间的具体调节机制有待进一步深入探讨。

综上所述，LncRNA PVT1、miR-31-5p与CHB病人炎症损伤程度密切相关，LncRNA PVT1、miR-31-5p二者联合检测可能作为CHB病人病情评估的生物学指标，具有重要的临床意义。但本研究尚存在不足之处，结果可能存在一定偏倚，有待后续进行研究完善。