利用单细胞藻类探究不同色光对光合作用的影响——以微囊藻与小球藻为例

施欣彤 姜锶濠 章熙东 谭啸

(1.南京外国语学校 江苏南京 210008)

(2.河海大学环境学院潜水湖泊综合治理与资源开发教育部重点实验室 江苏南京 210024)

光合作用是植物最基本的生命活动,是获得能量和释放氧气的重要途径,是地球上最重要的合成代谢之一,在苏教版高中生物学《必修1·分子与细胞》模块中占据重要地位,也是教学中的重难点。 《普通高中生物学课程标准(2017 年版)》明确,为了让学生更好地理解和掌握教学内容,教学中要高度重视学生的实践环节,力求为学生提供更多的动手实践机会。 因此,为帮助学生达成对“细胞的生存需要能量和营养物质,并通过分裂进行增殖”大概念的理解,促进学生生物学学科核心素养的提升,教师应开展“探究不同环境因素对光合作用的影响”的教学活动。 苏教版新教材必修1 提供了利用天竺葵为实验材料,探究“不同光质的单色光对植物光合作用的影响”的开放式实验,为学生提供了很好的学科实践机会。 但在教学中发现,以不同光质的光(用蓝色、红色、绿色玻璃纸遮光)为自变量,以光合产物淀粉含量为因变量开展实验,操作过程中对无关变量(如光照强度、温度)的控制较难,而且用碘液来鉴定淀粉,无法进行定量分析,使该实验的教学效果受到很大影响。 因此,教师可利用单细胞藻类如铜绿微囊藻(常见蓝藻)、小球藻(常见绿藻)为实验材料,用LED 灯管提供不同色光,以细胞浓度增加(细胞增殖)、藻类光合活性的变化(叶绿素荧光)为因变量,利用光照培养箱培养藻类以控制无关变量,利用叶绿素荧光技术对荧光参数进行定量分析,使实验的过程更具科学性,能很好地让学生进行定量研究的学科实践,有利于培养学生的创新精神和问题解决能力。

1 实验背景

铜绿微囊藻是常见的水华蓝藻,是原核藻类,蛋白核小球藻为常见绿藻,是真核单细胞藻类,二者在细胞结构、色素组成及光利用率上差异明显,常常在湖泊中共存或竞争生长。 自然水体中的有色可溶物、悬浮颗粒物及水分子等会选择性吸收不同波长的光,使得不同水域的水下光谱存在差异。 同时,深度也是水下光谱的影响因子之一,如随着水深的增加,蓝绿波段的光快速衰减使得红光所占的比例迅速增大。因此,探究不同色光对微囊藻和小球藻生长和光合活性的影响,利于让学生了解“富营养化水体中大量繁殖的蓝藻抑制了包括绿藻在内其他藻类的生长,造成了严重的水生态安全问题”,利于引导学生从水下光谱变化的角度深度思考蓝藻优势确立的原因,进而培养水环境保护意识。

光合活性表征的是藻细胞光合系统在一定条件下的状态,受到科学家普遍关注。 叶绿素荧光,作为光合作用研究的重要指标,包含了许多光合信息,几乎所有光合作用过程的变化均可通过叶绿素荧光反映出来。 藻类细胞的光合活性通常可用叶绿素荧光表征,经过暗适应的藻细胞在低强度测量光条件下会发出初始荧光F0,经过饱和脉冲高光强后发出最大荧光Fm(Fm为最大荧光,进而计算最大可变荧光Fv=Fm-F0)。Fv/Fm表征的是暗适应下PSⅡ(光系统Ⅱ)反应中心完全开放时的最大光合速率,常作为表达藻类光合活性是否受损的敏感性指标。 通常当藻类受到胁迫时,叶绿体中的光系统Ⅱ是首先而且也是主要损害的部位。 荧光测定技术可以不伤害生物体进行活体分析,因此通过研究叶绿素荧光来间接研究光合作用的变化是一种简便、快捷、可靠的方法。

2 实验方法

2.1 藻种

蛋白核小球藻与铜绿微囊藻(FACHB-469),均购自中国科学院水生生物研究所的淡水藻种库。

2.2 培养方法

将微囊藻与小球藻在光照培养箱中用BG11 培养基进行培养,温度设定为25±1 ℃,光暗周期比为12 h ∶12 h。 将藻种培养至对数期再进行无菌接种,初始接种浓度为5×104cells/mL。 共设置红光组、蓝光组和白光组。 红光或蓝光处理分别由LED 单色灯获得,通过改变光源距离培养锥形瓶的位置,分别调节红光组、蓝光组和白光组的光强,使各组光强均为45 μm·mol/(m2·s)。 藻种活化9 天后接种,进行正式实验,每个色光处理设置3 个平行,每天定时摇动锥形瓶3 次。

2.3 指标测定方法

2.3.1 藻细胞浓度测定

采用血球计数板每3 天对微囊藻培养液中藻细胞浓度计数,具体步骤如下:取洁净的血球计数板一块,在计数区上盖上一块盖玻片。 将藻悬液摇匀(在藻细胞生长后期,浓度较高的时期进行适当的稀释),用滴管吸取少许,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入藻悬液。 将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观察并计数。 计数区由25 个中方格组成,数左上、左下、右上、右下及中央1 个大方格的藻细胞数(即80 个小格)。

每个样品重复计数3 次(每次数值误差不超过10%,否则应重新操作),按公式计算出每mL 藻液所含细胞数量。 藻细胞浓度计算公式如下:

C=5N×104×n

式中:

C—1 mL 藻液中含有的藻细胞个数,cells/mL;

N—80 个小方格中细胞总数;

n—稀释倍数。

2.3.2 光合活性测定

取2 mL 藻液,暗适应20 min,采用叶绿素荧光仪(AquaPen-C AP-C100)测定藻细胞叶绿素a 荧光,测得参数最大荧光(Fm)、最小荧光(F0)、可变荧光强度Fv(即Fm-F0)、PSⅡ原初光能转换效率(Fv/F0)、PSⅡ的潜在活性(Fv/Fm)。

3 结果与讨论

3.1 不同色光对藻类生长的影响

铜绿微囊藻属于水华蓝藻,而蛋白核小球藻为常见绿藻。 由于蓝藻与绿藻细胞内色素组成存在差异,因而两者在可见光(400—800 nm)的吸收光谱有较大差异。 两种藻的光合系统均含有叶绿素a,440 nm 和680 nm 为叶绿素a 的特征吸收峰。 它们之间的差异色素为各自的捕光色素,微囊藻的捕光色素为藻胆素(以藻蓝素为主,特征吸收峰为620 nm),且不含叶绿素b 和叶绿素c,使得它能够利用红橙色波段(600—650 nm)的可见光。 而小球藻含有的叶绿素b 可以吸收蓝光波段(450—550 nm)的可见光。

细胞内色素的种类决定了藻类的吸收光谱,使其在与捕光色素吸收光谱相似的色光下生长更具优势。研究发现,微囊藻在红光下出现最大细胞浓度(2.3×107cells/mL),小球藻的在蓝光下出现最大细胞浓度(1.4×107cells/mL)(图1)。

图1 不同色光下微囊藻(a)和小球藻(b)的生长曲线

3.2 不同色光对藻类光合活性的影响

本研究采用叶绿素荧光及JIP test 进一步分析光质对光系统Ⅱ能量传递的影响。 经过充分暗适应的藻细胞受到光激发(20—50 μs)处于初始相O相,此时PSⅡ反应中心处于完全开放的状态,测得初始荧光(F0)。 O—J 反映了光合作用的光化学阶段,当反应结束,所有反应中心处于关闭状态,不再接受光量子时,此时达到最大的荧光产量(Fm),P 相出现。 OJIP 曲线记录了从F0到Fm的整个变化过程,且通过JIP 测定(JIP test)可表征PSⅡ反应中心、电子供体侧和电子受体侧的具体生理状态(表1)。

经红光、蓝光和白光培养24 天后,微囊藻与小球藻的叶绿素a 快速荧光曲线如图2 所示。 微囊藻和小球藻在不同色光下光合系统Ⅱ都出现变化,色光明显影响P 点相对最大荧光值。 其中蓝光和红光对微囊藻的相对最大荧光值有促进作用,并且蓝光的促进作用更明显。 而对于小球藻,红光表现促进作用,而蓝光表现出抑制作用。

图2 不同色光下微囊藻(a)和小球藻(b)的OJIP 曲线

作为光系统Ⅱ重要的部分,光合反应中心既从捕光天线(供体侧)接受电子还原QA变成Q-A,然后再还原为QA传递电子到受体侧。 本研究选取ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC 几个参数来反映单位光合反应中心的能量传递情况(图3)。

图3 不同色光下微囊藻(a)和小球藻的(b)JIP-test参数(与白光组对照)

结果表明,在红光和蓝光下培养小球藻,有利于其反应中心的还原作用和电子传递,但两种色光的影响作用差异较小,而红光和蓝光对微囊藻的这两个过程几乎没有影响。 色光对微囊藻和小球藻反应中心的影响差异主要在于捕光色素吸收的能量和耗散能量。 以反应中心为单位,相比于白光,红光和蓝光下培养的微囊藻的ABS/RC 均显著降低,表明其捕光复合体被抑制。 相反,小球藻在蓝光和红光下捕光复合体被促进,说明经过不同色光处理后,藻细胞的捕光复合体会因为光适应增大或者减小。 这些变化还可能与捕光复合体在光系统Ⅰ和光系统Ⅱ之间的迁移有关。 研究显示,绿藻中Chl a/Chl b 复合体在光系统Ⅰ和光系统Ⅱ之间的迁移影响了捕光复合体,而在蓝藻中也存在着类似的PBS/Chl a 迁移。

Fv/Fm 能够表征反应中心内的光能转化效率,反映藻细胞潜在的光合能力。 本研究发现,两种藻的潜在光合作用能力并没有在生长较好的色光下出现最大值,反而表现为在生长较慢的色光下更强。 结合OJIP曲线与生长曲线,在实验末期,蓝光下微囊藻细胞浓度最低,但潜在光合作用能力(Fv/Fm)更强(图3a)。 相反,红光下小球藻细胞浓度最低,但其潜在光合作用能力更强(图3b),但是两者光合作用能量的积累仍受到捕光色素吸收能量的限制,且此时质体醌数量和活性的改变也不利于QA接受供体侧电子被还原,实际初始荧光速率仍表现为在两种藻适宜生长的色光下更大。

4 实验结论

本研究探究了色光对铜绿微囊藻与蛋白核小球藻生长的影响。 实验结果发现色光会显著影响藻类生长和光合效率。 红光有利于铜绿微囊藻的生长,蓝光有利于蛋白核小球藻的生长。 且在共培养体系,微囊藻在红光下获胜,小球藻在蓝光下获胜。 叶绿素荧光和OJIP 结果表明,色光对藻细胞光合系统Ⅱ中的捕光色素及电子受体具有显著影响,色光影响捕光色素复合体的大小、质体醌数量和活性。

5 教学反思

基于真实情境的问题解决更有利于培养学生的生物学科核心素养,源于教材但高于教材的探究活动兼具知识学习、能力培养和素养发展等教学功能。 本实验结合学生有关富营养化和藻华等生活认知经验,采用藻类荧光仪等现代测量技术手段进行学科实践,突破了学习难点,同时加深了学生对科学、技术、社会相互关系的认识。 教师教学时要组织好观察、实验等探究性学习活动,帮助学生增加感性认识,克服对微观结构认识的困难,使学生领悟科学研究的方法并习得相关的操作技能。 让探究活动沿着“实践、认识、再实践、再认识”的螺旋上升式轨迹走向深处,用问题启发思考,用“已知”探索“未知”,并在创造性解决问题中丰富相关学习经历。 让中学生物学课堂浸润科学的气息、充满科学的味道是素养时代下每个教师努力的方向。