壳聚糖-纤维素纳米纤维复合膜的制备及表征

陈晓霞，邱宇龙，李仪茜，毕景然

（大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034）

随着人们生活水平的日益提高，食品质量和安全问题越来越受到消费者的广泛关注。目前石油衍生聚合物在食品保鲜领域得到了广泛的开发和应用，但由于其不可回收及不可生物降解性，消费者对天然生物聚合物材质的食品保鲜膜认同度更高[1-2]。

壳聚糖（chitosan，CS）是一种天然的阳离子多糖，具有良好的成膜性、生物降解性[3]、抗氧化性和抗菌活性[4]，因此，CS 基复合膜被广泛应用在食品保鲜方面[5]。然而，由于CS 糖苷链上的分子内和分子间的网络链间隙，导致CS 基复合膜机械性能较差，限制了CS 的实际利用[6]。纤维素是一种天然大分子多糖，由β-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成，结晶度高，由纤维素I 晶型和无定形区组成。由氧化法制备的纤维素纳米纤维（cellulose nanofibrils，CNF），在纤维素分子上引入了大量的羧基，具有高长径比、高比表面积以及无定形晶体结构，能够通过氢键建立牢固的纳米纤维素网络结构，可作为复合膜的增强填料[7]。Yadav等[8]采用共混法制备了CNF/CS 绿色复合薄膜，随着CNF 添加量的增加，复合膜的吸湿率和水溶性都呈现下降趋势，可作为食品包装用于食品保鲜。Tang 等[9]以CNF为增强填料，制备了可降解、透明度高的CS/瓜尔胶（guar gum，GG）/CNF 纳米复合膜，与纯CS/GG 膜相比，CS/GG/CNF 纳米复合膜的抗拉强度更大，氧气透过率更低，是一种潜在的新型食品包装材料。京尼平（genipin，GP） 是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，化学结构具有羟基、羧基等多个活性基团，其毒性与人工合成的化学交联剂相比较小[10]。京尼平作为京尼平苷的苷元衍生物，可用于多种天然生物材料的交联，是一种优良的天然生物交联剂，可以与CS 分子上的伯氨基反应生成杂环胺，引发CS 分子通过短桥结构进行有序的交联[11]。通过GP 交联形成的大分子网络结构，交联程度高、性质稳定、阻隔性能强。

本研究以丝瓜络为原料，通过2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物（2，2，6，6-tetramethyl-1-piperidinyloxy，TEMPO）氧化法制备CNF。以GP 作为交联剂，通过在CS 中添加不同量的CNF，制备CS-GP-CNF 复合膜，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）及X 射线衍射（X-ray diffractometer，XRD）等技术对复合膜的结构进行表征，探究复合膜的交联机制，并研究不同添加量的CNF 对复合膜水蒸气透过率的影响，探讨CS-GP-CNF 复合膜在鸡肉冷藏保鲜中的应用效果，以期为天然食品包装膜的制备提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丝瓜络：天津品煜悠佳商贸有限公司；CS（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；GP（98%）、脂肪醇聚氧乙烯醚：上海麦克林生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、乙酸、盐酸、氢氧化钾、次氯酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；溴化钠、TEMPO（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

中草药粉碎机（FW177）：天津市泰斯特仪器有限公司；恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：深圳市三莉科技有限公司；电热鼓风干燥箱（GFL-70）：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；自动凯氏定氮仪（K9840）：山东海能科学仪器有限公司；透射电子显微镜（JEM-2100）、SEM（JSM-7800F）：日本电子株式会社；傅里叶变换红外光谱仪（Spectrum II）：铂金埃尔默仪器有限公司；X 射线衍射仪（XRD-7000S）：日本岛津公司；真空冷冻干燥机（FD8-3）：美国Siemon 公司。

1.3 方法

1.3.1 纤维素的制备

将40 g 丝瓜络用中草药粉碎机粉碎，加入至10g/L的脂肪醇聚氧乙烯醚（质量浓度2%）渗透剂中，连续搅拌24 h 后，用去离子水彻底清洗样品，之后采用乙酸乙酯萃取。在75 ℃下缓慢加入40 mL 乙酸和60 g 次氯酸钠。过滤后的样品在90 ℃下与400 mL 氢氧化钾溶液（5%）混合搅拌2 h，去除半纤维素。在80 ℃下，利用400 mL 盐酸（1%）搅拌剩余样品2 h 后，用去离子水洗涤至中性，采用真空冷冻干燥机冻干得到纤维素粉。

1.3.2 CNF 的制备

将1 g 纤维素粉与100 mL TEMPO-NaBr 溶液（含0.1 g TEMPO 和0.016 g NaBr）混合，在30 ℃下搅拌4 h，搅拌过程中缓慢滴加0.5 mol/L NaOH 溶液，调节反应溶液至pH10。加入10 mL 无水乙醇终止反应，将反应后的产物用去离子水反复润洗至中性，10 000 r/min 离心10 min，去除上层清液，将沉淀冻干即得CNF[12]。

1.3.3 CS-GP-CNF 复合膜的制备

将CS（1.5 g）溶于100 mL 1%乙酸溶液中，搅拌6 h，制得1.5% CS 溶液。随后，将CNF 分别按CS 的0%、1%、2%、3%、6%（质量分数） 加入到CS 溶液中。搅拌20 min 后，加入终浓度为0.15 mmol/L 的GP 水溶液，搅拌30 min，制备CS-GP-CNF 交联溶液。超声1 h 后，将200 mL CS-GP-CNF 交联溶液倒入模具（30 cm×25 cm）中，在40 ℃下干燥2 h，形成干燥的复合膜，样品分别记为CS-GP-CS、CS-GP-CNF1、CS-GP-CNF2、CS-GPCNF3、CS-GP-CNF6。

1.3.4 测试与表征

1.3.4.1 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察

将一滴用去离子水稀释的CNF 悬浮液滴在有碳涂层的铜网上，然后用乙酸双氧铀复染2 min，并在室温下晾干。使用TEM 观察CNF 形貌。

1.3.4.2 FTIR 分析

使用溴化钾压片后对CNF 进行扫描，扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1；对CS-GP-CNF 复合膜进行扫描，扫描范围为4 000～650 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.3.4.3 XRD 分析

XRD 谱图扫描范围为5°～60°，扫描速度为5°/min。结晶度计算公式如下。

Cr=（I002-Iam）/Iam

式中：Cr为结晶度，%；I002为（002）面衍射的最大强度；Iam为样品非晶态部分散射的强度。

1.3.4.4 SEM 观察

将CS-GP-CNF 复合膜用液氮冷冻后脆断，喷金，利用SEM 对复合膜的横切面进行微观形貌分析。

1.3.4.5 水蒸气透过率（water vapor permeability，WVP）测定

采用WVP 测试系统对样品进行水蒸气透过率的测试[13]。将CS-GP-CNF 复合膜剪成直径60 mm 的圆形，固定在装有20 mL 饱和NaCl 溶液的称量瓶（相对湿度为75%）的顶部，然后放置在装有CaCl2的干燥器（相对湿度0%）内。每隔24 h 定期对试验容器进行称重，连续称量3 d。水蒸气透过率计算公式如下。

W=（△m×x）/（A×△t×△P）

式中：W为水蒸气透过率，g/（s·m·Pa）；△m 为试验前后的质量差，g；x为复合膜的平均厚度，m；A 为复合膜面积，m2；△t 为测量时间差，s；△P 为复合膜两侧的水蒸气压差，2 809 Pa。

1.3.5 CS-GP-CNF6在鸡肉贮藏中的应用

为评价复合膜的实际应用价值，以CS-GP-CNF6复合膜为包装材料对鸡肉进行保鲜。将鸡胸肉在120 ℃的高温下油炸2 min，然后转移至沸水中煮15 min，以模拟烧鸡加工工艺。将鸡肉切成2 cm×2 cm×2 cm 的小块，用制备好的复合膜包覆鸡肉，试验组分别为CS-GPCNF6、商用聚乙烯保鲜膜和未包膜空白组。将包覆好的鸡肉放于4 ℃冰箱冷藏，分别贮藏1、3、5、7、10 d 后测定样品的菌落总数和挥发性盐基氮含量。

1）菌落总数测定：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行鸡肉中菌落总数的测定[14]。

2）挥发性盐基氮含量的测定：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》进行鸡肉中挥发性盐基氮含量的测定[15]。

1.4 数据分析

利用Excel 2010 软件对试验数据进行整理与分析，使用Origin 2021 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 CNF 的性质

2.1.1 TEM 分析

CNF 的TEM 图像见图1。

图1 CNF 的TEM 图像Fig.1 TEM images of CNF

从图1 中可以发现CNF 的平均宽度为（7.3±3.6）nm，平均长度为（156.3±46.9）nm。CNF 长径比可高达21.41，因此，可作为复合膜的增强填料，以提高其阻隔性能。另外，纤维素粉经过TEMPO 催化处理后，CNF之间存在团聚现象，这是由于氧化作用导致纤维素分子中大部分—OH 和—COOH 等亲水性基团暴露，在分子内及分子间形成大量氢键，引发团聚[16]。

2.1.2 FTIR 分析

CNF 的FTIR 图像见图2。

图2 CNF 的FTIR 谱图Fig.2 FTIR spectrum of CNF

由图2 可知，在3 361～3 343 cm-1处出现较强较宽的吸收峰，这是由—OH 伸缩振动产生的纤维素的特征峰。在2 910 cm-1处存在的尖峰对应为C—H 的伸缩振动吸收峰，在1 649 cm-1处的特征峰是酰胺基Ⅰ的弯曲振动，1 200 ～1 000 cm-1吸收带属于—C—O—的伸缩振动峰，890 cm-1处对应的是纤维素C—H 的变形振动[17]。木质素对应的芳香骨架振动峰（1 510 cm-1）、C—H 伸缩振动峰（1 246 cm-1）和弯曲振动峰（828 cm-1）在CNF 图谱中没有显示，说明原料中的木质素已完全通过TEMPO 氧化被去除。

2.1.3 XRD 分析

通过氧化反应制备的CNF 的XRD 结果见图3。

图3 CNF 的XRD 谱图Fig.3 XRD spectrum of CNF

由图3 可知，CNF 在2θ=15.8°、22.4°和34.42°附近处出现明显的衍射峰，分别代表了纤维素I 型结晶结构的（110）、（012）以及（040）晶面。计算得到CNF 的结晶度为72.3%，这说明TEMPO 氧化可能只发生在纤维素的无定形区，对内部晶区影响不大，因此纤维素的晶型结构得以保持。

2.2 复合膜的性质

2.2.1 SEM 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 复合膜的横切面形貌见图4。

图4 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 复合膜的横切面形貌Fig.4 Cross-section images of CS-GP-CS and CS-GP-CNF composite films

由图4 可知，在化学交联剂京尼平的作用下，CS可以充分交联，形成结构完整，表面均一、光滑、无气泡的CS-GP-CS 复合膜。Costa 等[18]的研究表明，随着CNF 添加量的逐渐增大，京尼平分子中的酯基（C-11）逐渐被CNF 取代，产生了高分子量的酸酐基团，并通过氢键作用形成了结节状网络结构，由此造成复合膜表面形貌的粗糙节点，其中CS-GP-CNF6复合膜的横切面形貌明显出现小型白色团聚结构。

2.2.2 FTIR 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 复合膜的FTIR 谱图见图5。

如图5 所示，CS-GP-CS 复合膜的FTIR 谱图中，在3 434 cm-1和2 854 cm-1处存在CS 分子中O-H 和C-H 基团的伸缩振动典型吸收峰。由于CS 的氨基与京尼平C-3 处的烯烃碳原子发生了亲核取代反应，因此，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 复合膜在1 452 cm-1处均存在与C-N 的伸缩振动相关的吸收峰。同时，GP 分子C-11 上的酯基分别被CS 和CNF 取代，分别对应仲酰胺（1 637 cm-1）和酸酐（1 459 cm-1）的吸收峰，证明CSGP-CS 和CS-GP-CNF 复合膜中存在化学交联作用。

2.2.3 晶体结构

CNF、CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 复合膜的XRD谱图见图6。

如图6 所示，CS-GP-CS 复合膜的XRD 谱图在2θ=8.18°、11.68°、18.26°处存在3 个衍射峰，在23.54°处有一个宽峰，这是典型的半晶指纹图谱。当CNF 通过GP 与CS 交联时，CNF 分子中的羧基被交联剂取代。因此，交联网络体系中分子间和分子内氢键的分布发生了部分改变，但其规律性并未被明显破坏。此外，由于CNF 的典型纤维素I 结构的晶体平面与CS的衍射峰重叠，因此，CS-GP-CNF 复合膜的XRD 谱图形状与CS-GP-CS 相似。随着CNF 添加量的逐渐增大，2θ=11.68°处的衍射峰逐渐增大，说明CS-GP-CNF复合膜的面间距离变小。

2.2.4 WVP 测定结果

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 复合膜的水蒸气透过率见表1。

表1 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 复合膜的水蒸气透过率Table 1 Water vapor permeability of CS-GP-CS and CS-GPCNF films

阻隔性能是食品包装材料防止食品腐败的重要指标，特别是优良的阻水特性可有效避免微生物繁殖。水蒸气透过率可反映包装食品与周围大气之间的水分交换速率。如表1 所示，由于化学交联剂GP 的作用，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 复合膜的交联结构紧密，均展现出较高的防潮性能。虽然CNF 表面亲水位点丰富，具有较高的亲水性，但CS-GP-CNF 复合膜的WVP 仍较低，如CNF 含量最高的CS-GP-CNF6复合膜的WVP 为1.14×10-11g/（s·m·Pa），远低于玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合膜[4.62×10-6g/（s·m·Pa）][19]。

2.2.5 CS-GP-CNF 复合膜在鸡肉贮藏中的应用

2.2.5.1 菌落总数

不同包装材料对冷藏鸡肉菌落总数的影响见图7。

图7 不同包装材料对冷藏鸡肉菌落总数的影响Fig.7 Effect of different films on colony number of chicken during refrigerated storage

如图7 所示，在4 ℃条件下，随着贮藏时间的延长，各组鸡肉的菌落总数不断增加，其中，未包膜空白组鸡肉的菌落总数上升速率最大，在贮藏第3 天达到（4.49±0.14）lg（CFU/mL），超过了GB/T 20558—2006《地理标志产品符离集烧鸡》[20]中规定的菌落总数限值4.47 lg（CFU/mL）。商用聚乙烯保鲜膜虽对鸡肉具有保护作用，但在第10 天时，鸡肉的菌落总数达到了（5.10±0.21）lg（CFU/mL）。由于CS 良好的抑菌性[21]及复合膜的防潮特性，在贮藏第10 天时，被CS-GPCNF6复合膜包覆的鸡肉菌落总数仍未超过标准限值，仅为（4.16±0.09）lg（CFU/mL），表明CS-GP-CNF6复合膜可以有效地抑制鸡肉的细菌生长。

2.2.5.2 鸡肉的挥发性盐基氮含量

挥发性盐基氮是判断肉制品新鲜度的重要指标之一。在内源酶和微生物的作用下，蛋白质会被降解成小分子氨和胺类，可通过凯氏定氮法测定挥发性盐基氮含量。不同包装材料对冷藏鸡肉挥发性盐基氮含量的影响见图8。

由图8 可知，新鲜鸡肉的初始挥发性盐基氮含量为（10.0±0.5）mg/100 g，各组的挥发性盐基氮含量变化趋势基本一致，均随着贮藏时间的延长而升高。参照肉制品新鲜度判定标准：挥发性盐基氮含量一级鲜度≤15.00 mg/100 g，二级鲜度≤25.00 mg/100 g[21]。未包膜空白组鸡肉的挥发性盐基氮含量在贮藏1 d 后达到18.70 mg/100 g，由一级鲜度转为二级鲜度，且在第7天超过25.00 mg/100 g。商用聚乙烯保鲜膜包裹的鸡肉样品于贮藏第3 天转为二级鲜度，贮藏第7 天时挥发性盐基氮含量为25.31 mg/100 g。相比之下，CS-GPCNF6复合膜包覆鸡肉的挥发性盐基氮含量整体低于未包膜空白组和商用聚乙烯保鲜膜组。CS-GP-CNF6组鸡肉的挥发性盐基氮含量在贮藏第5 天时仅为16.20 mg/100 g，且可保障鸡肉的二级鲜度直至第10天（此时鸡肉挥发性盐基氮含量为21.20 mg/100 g），表明CS-GP-CNF 复合膜具有潜在的食品保鲜能力。

3 结论

本文以丝瓜络为原料制备了长径比为21.41 的CNF，并以CNF 及天然多糖聚合物CS 为原料，通过GP 化学交联，制备了表面均一、光滑、无气泡的CSGP-CNF 复合膜。当CNF 添加量为CS 质量的6%时，所制备的CS-GP-CNF6复合膜的水蒸气透过率仅为1.14 × 10-11g/（s·m·Pa）。以CS-GP-CNF6复合膜包覆鸡肉样品，评价其在食品保鲜领域的实际应用价值，结果显示，在4 ℃下贮藏10 d 时，鸡肉的菌落总数和挥发性盐基氮含量分别为（4.16±0.09）lg（CFU/mL）和21.20 mg/100 g，保鲜效果明显优于未包膜空白组和商用聚乙烯保鲜膜组。