干扰LncRNA BCYRN1 对乳腺癌MCF-7 细胞增殖、运动和移植瘤生长的影响

吉棚 ,赵华山 ,王晨 ,刘淑荣 ,马建增

阳光融和医院1乳腺甲状腺外科,2肿瘤内科 山东省潍坊市,261000

乳腺癌是乳腺上皮细胞癌变引起的恶性肿瘤,虽然我国属于乳腺癌低发区域,但近年来我国乳腺癌发病年龄趋向年轻化[1-2]。目前对于乳腺癌的治疗主要以手术切除为主,虽然辅助化疗能够显著提高乳腺癌患者的治疗效果[3-4],但外科创伤、化疗也会对癌症患者身体带来创伤,对乳腺癌发病、进展相关基因作用机制的研究有助于治疗药物研发,为癌症疾病治疗提供新的思路[5]。长链非编码RNA (long noncoding RNA,LncRNA) 是参与肿瘤细胞生物学行为过程的无蛋白质编码功能的RNA分子,有研究显示LncRNA BCYRN1 在肺腺癌细胞中表达上调,还能影响肺腺癌细胞周期阻滞、侵袭和迁移能力,LncRNA BCYRN1 高表达患者的预后较差[6]。但LncRNA BCYRN1 在乳腺癌中的作用机理研究较少,本研究借助短发卡RNA (short hairpin RNA,shRNA) 技术沉默BCYRN 表达,探讨shRNA 干扰LncRNA BCYRN1 对乳腺癌MCF-7 细胞行为、移植瘤生长的影响及其潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织样本、实验细胞及动物

乳腺癌组织及癌旁组织源于本院行乳腺癌根治术切除组织,共计30 例,乳腺癌患者年龄25～46岁,平均(35.3 ±5.9) 岁。乳腺癌细胞株MCF-7购自中国科学院细胞库;SPF 级3 周龄雌性裸鼠40只购自潍坊医学院[SCXK (鲁) 20200001],体重(20 ±4) g。

1.2 主要试剂与仪器

Ki67 抗体(货号: ab 245113;批号20190209)、E-钙粘蛋白(E-cadherin) 抗体(货号: ab 194982;批号: 20190408)、N-钙粘蛋白(N-cadherin) 抗体(货号: ab 198496;批号: 20190601)、波形蛋白(Vimentin) 抗体(货号: ab92547;批号20190411) 均购自艾博抗(上海) 贸易有限公司;山羊抗大鼠IgG荧光二抗(货号: E-AB-1021) 购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;Lipofectamine®2000 购自上海研谨生物科技有限公司;RPMI1640 培养基、青霉素、链霉素、丝裂霉素均购自美国sigma 公司;TRIzol 试剂购自Thermo Fisher 公司。

细胞培养箱购自美国Forma 公司;低温离心机购自德国eppendorf 公司;切片机、英冠显微镜购自德国Leica 公司;实时荧光定量PCR 仪购自美国伯乐公司。

1.3 细胞培养、分组及转染

将乳腺癌MCF-7 细胞放于培养箱内培养(37 ℃、5 % CO2),RPMI1640 培养基含有10 %FBS、100 U/mL 青霉素、链霉素。将乳腺癌MCF-7 细胞分为空白对照组(Control)、阴性对照组(shRNA-NC)和干扰组(sh-BCYRN1),用于后续实验,按照说明书,将sh-BCYRN1 稳定表达下调的质粒转染干扰组细胞,将无义序列shRNA 质粒转染阴性对照组细胞,培养48 h,使用RT-PCR 检测细胞BCYRN1 表达。

1.4 实时定量PCR (real-time quantitative PCR,RTPCR) 检测BCYRN1 相对表达量

Trizol 提取细胞总RNA,反转录合成cDNA 链,以此链为模板,采用定量PCR 仪扩增,以GADPH为内参照基因,95 ℃预变性2 min;95 ℃变性8 s,58 ℃退火35 s,72 ℃延伸40 s,40 个循环。目的基因表达相对值RQ=2-ΔΔCt。引物由TAKARA 公司合成,β-肌动蛋白(β-actin) 上游引物5′-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA-3′,下游引物 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3′;BCYRN1 上游引物5′-AGACCTGCCTGGGCAATATAG-3′,下游引物5′-GTTGTTGCTTTGAGGGAAGTTACG-3′。

1.5 Edu 法检测细胞增殖

使用Edu 法检测细胞增殖,详细操作参考文献[7],在400 倍显微镜下观察Edu 阳性细胞数。

1.6 Transwell 检测细胞侵袭情况

取对数生长期细胞并将密度调整为1 ×105个/mL,将细胞接种至Transwell 小室(上室为无血清培养基、下室为含血清培养基),24 h 后,4 %多聚甲醛固定细胞,0.1 %结晶紫染色细胞,高倍镜下选取3 个不重叠视野对染色细胞进行拍照,重复3 次,统计细胞数。

1.7 划痕实验检测细胞迁移能力

将细胞接种至24 孔板(5 ×105个/孔),按照上述细胞培养条件培养24 h,全培养基润洗,加入10 μmol/L 丝裂霉素,培养2 h,加入完全培养基,分别在0 h 和24 h 时拍照,重复3 次。

1.8 免疫荧光检测Vimentin 表达

待细胞贴壁生长后,收集细胞涂片,4 %多聚甲醛固定15 min,Triton X-100 透膜10 min,正常非免疫兔血清封闭30 min,加入大鼠抗人Vimentin一抗稀释液(1∶100) 4 ℃过夜,每张涂片滴加山羊抗大鼠IgG 荧光二抗稀释液(1∶400) 37 ℃反应30 min,晾干后抗荧光猝灭封片剂封固,于荧光显微镜观察细胞Vimentin 表达。

1.9 蛋白质印迹法(Western blotting) 检测蛋白表达水平

待细胞贴壁生长后使用胰蛋白酶处理,提取总蛋白,10 %的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在100 V电压分离,0.65 mA/cm2恒定电流转移1.5 h 至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜,使用5 %的脱脂奶粉恒温封闭2 h,加入各需要检测蛋白的一抗、二抗,孵育2 h,Tris 缓冲盐水与吐温20 (Tris Buffered Saline with Tween 20,TBST)洗净,以β-actin 为内参蛋白,实验重复3 次。

1.10 裸鼠体内移植瘤实验

收集对数期的MCF-7 细胞,将MCF-7 细胞悬液(3.5 ×107个/mL) 于裸鼠腋下注射,4 μL/只,待成瘤后(成瘤标准: 移植瘤直径＞5 mm),将成瘤裸鼠随机数字表法分为空白对照组(Control)和干扰组(sh BCYRN1),每组各20 只,干扰组、空白对照组分别给予sh-BCYRN1 质粒转染、无义序列shRNA 质粒转染移植瘤,继续饲养4 周,麻醉处死裸鼠,分离移植瘤,RT-PCR 检测移植瘤BCYRN1 表达,称重肿瘤质量,蛋白质印迹法检测移植瘤Ki67、N-cadherin 蛋白表达。

1.11 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验;两组间差异比较用t检验;检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织BCYRN1 表达情况及转染效率检测结果

乳腺癌组织、癌旁组织BCYRN1 表达的RTPCR 实验结果表明,乳腺癌组织BCYRN1 表达显著高于癌旁组织(P＜0.05),说明BCYRN1 在乳腺癌组织中呈高表达趋势 (图1A)。转染细胞BCYRN1 表达的RT-PCR 实验结果表明,阴性对照组、空白对照组BCYRN1 表达无显著变化(P＞0.05),比较空白对照组和阴性对照组,干扰组BCYRN1 表达显著降低(P＜0.05),说明细胞转染成功(图1B)。

图1 乳腺癌组织BCYRN1 表达及MCF-7 细胞转染后的BCYRN1 表达

2.2 干扰LncRNA BCYRN1 对MCF-7 细胞Ki67 蛋白表达的影响

Edu 实验结果表明,与空白对照组比较,阴性对照组Edu 阳性细胞百分比无显著变化 (P＞0.05);比较空白对照组和阴性对照组,干扰组Edu 阳性细胞百分比显著减少(P＜0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 细胞增殖(图2A、B)。

图2 Edu 结果及细胞Ki67 蛋白表达情况

蛋白质印迹实验结果表明,与空白对照组比较,阴性对照组Ki67 蛋白表达无显著变化(P＜0.05);与空白对照组和阴性对照组比较,干扰组Ki67 蛋白表达显著降低(P＜0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 能降低乳腺癌MCF-7 细胞Ki67 蛋白表达(图2C)。

2.3 干扰LncRNA BCYRN1 对MCF-7 细胞侵袭的影响

Transwell 实验结果表明,与空白对照组比较,阴性对照组单个视野细胞侵袭数目无显著变化(P＞0.05)。

与空白对照组和阴性对照组比较,干扰组单个视野细胞侵袭数目显著降低(P＜0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 细胞侵袭(图3)。

图3 各组细胞侵袭情况

2.4 干扰LncRNA BCYRN1 对MCF-7 细胞迁移的影响

划痕实验结果表明,与空白对照组比较,阴性对照组细胞迁移率无显著变化(P＞0.05);与空白对照组和阴性对照组比较,干扰组细胞迁移率显著下降(P＜0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 能抑制乳腺癌MCF-7 细胞迁移(图4)。

图4 各组细胞迁移情况

2.5 干扰LncRNA BCYRN1 对MCF-7 细胞运动能力的影响

蛋白质印迹实验结果表明,与空白对照组比较,阴性对照组E-cadherin、N-cadherin 蛋白表达无显著变化(P＞0.05);比较空白对照组和阴性对照组,干扰组N-cadherin 蛋白表达显著降低,Ecadherin 蛋白表达升高(P＜0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 能通过降低N-cadherin 蛋白表达,升高E-cadherin 蛋白表达,抑制乳腺癌MCF-7 细胞运动能力(图5A)。免疫荧光实验结果表明,与空白对照组比较,阴性对照组Vimentin 阳性率无显著变化(P＞0.05);与空白对照组和阴性对照组比较,干扰组Vimentin 阳性率显著降低(P＜0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 能抑制Vimentin 表达来影响乳腺癌MCF-7 细胞运动(图5B)。

图5 MCF-7 细胞运动能力检测结果

2.6 干扰LncRNA BCYRN1 对裸鼠移植瘤生长的影响

移植瘤RT-PCR 实验结果表明,与空白对照组比较,干扰组BCYRN1 表达显著降低(P＞0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 裸鼠移植瘤构建成功(图6A)。移植瘤质量称重实验表明,干扰组裸鼠移植瘤质量低于空白对照组(P＜0.05),说明干扰LncRNA BCYRN1 能抑制裸鼠移植瘤生长(图6B),移植瘤蛋白质印迹实验结果表明,与空白对照组比较,干扰组移植瘤组织Ki67、N-cadherin 蛋白表达降低 (P＜0.05),说明干扰 LncRNA BCYRN1 可能通过降低Ki67、N-cadherin 蛋白表达来抑制移植瘤生长(图6C、D)。

图6 干扰LncRNA BCYRN1 对裸鼠移植瘤生长的影响

3 讨论

LncRNA BCYRN1 在非小细胞肺癌患者血清中呈高表达趋势且与患者不良预后存在密切关系[8],还能通过调节细胞侵袭信号通路调节结直肠癌细胞的侵袭转移能力[9],BCYRN1 高表达能促进卵巢癌细胞增殖和转移[10]。本研究结果显示,乳腺癌癌组织BCYRN1 表达明显高于癌旁组织,说明BCYRN1 可能参与乳腺癌发病或进展过程。本研究通过shRNA 沉默MCF-7 细胞中BCYRN1 表达,结果显示LncRNA BCYRN1 低表达MCF-7 细胞的Edu阳性细胞百分比降低,且Ki67 蛋白表达降低。Ki67 在细胞增殖过程中占据重要作用,在多种肿瘤组织呈高表达趋势[11-12],Ki67 高表达与乳腺癌组织微血管密度存在关系[13]。说明shRNA 干扰LncRNA BCYRN1 能降低乳腺癌MCF-7 细胞增殖能力,可能是通过降低细胞Ki67 蛋白表达实现对癌细胞增殖抑制作用。

LncRNA 可通过调节瘤细胞增殖、运动能力、凋亡以及耐药性等参与原发性肿瘤进展,LncRNA参与乳腺癌细胞生物学行为过程[14-15],具有潜在诊断价值。乳腺癌经根治术治疗后仍存在术后复发、远处转移风险,这与乳腺癌细胞较强侵袭、迁移能力有关。本研究结果显示,LncRNA BCYRN1低表达MCF-7 细胞的单个视野细胞侵袭数目、细胞迁移率均呈明显降低趋势,与Zhou 等[16]研究结果趋势,说明shRNA 干扰LncRNA BCYRN1 会降低乳腺癌MCF-7 细胞侵袭和迁移能力。乳腺癌细胞侵袭、迁移能力强于正常组织细胞,与上皮间质转化有关,有研究表明阻断乳腺癌细胞上皮间质转化过程可以降低乳腺癌细胞侵袭、迁移能力[17]。E-cadherin 为上皮细胞标志蛋白,N-cadherin 参与细胞间的黏附过程,N-cadherin 在上皮间质转化中表达上调[18]。Vimentin 为细胞骨架组成部分,同时也是间质细胞标志蛋白,其表达水平升高提示肿瘤细胞的浸润能力增强[19]。本研究结果显示,LncRNA BCYRN1 低表达MCF-7 细胞N-cadherin 蛋白表达和Vimentin 阳性率均呈明显降低趋势,而Ecadherin 蛋白表达呈明显升高趋势,与皮亚平等[20]研究结果相似,说明shRNA 干扰LncRNA BCYRN1可能通过调节上皮间质转化中的E-cadherin、Ncadherin、Vimentin 蛋白表达来调节乳腺癌细胞侵袭、迁移能力。裸鼠成瘤实验在肿瘤学、免疫学以及药物安全性评估、筛选方面有着特殊意义,本研究通过裸鼠移植瘤实验发现LncRNA BCYRN1 低表达裸鼠移植瘤质量和移植瘤组织Ki67、N-cadherin蛋白表达降低,说明shRNA 干扰LncRNA BCYRN1能抑制乳腺癌移植瘤生长,与降低移植瘤组织Ki67、N-cadherin 蛋白表达有关。

综上所述,shRNA 干扰LncRNA BCYRN1 对乳腺癌MCF-7 细胞增殖、侵袭、迁移能力有抑制作用,其作用机制可能与调节细胞增殖、上皮间充质转化相关蛋白表达有关,还能抑制裸鼠移植瘤生长。乳腺癌恶性行为机制复杂,调控途径多样,本研究还存在未能阐明LncRNA BCYRN1 是通过何种信号途径调节乳腺癌恶性行为,后续将开展深入探究。