线粒体自噬在敌草快中毒肾近曲小管损伤中保护作用的研究进展

杨登会,罗澜,刘小露,胡杰,吴瑾,赖福平,陆安静,喻安永,王瑞烈,2,陆元兰,2

(遵义医科大学附属医院 1.急诊科,2.门诊部,贵州 遵义 563003)

自我国禁用百草枯(paraquat, PQ)以来,敌草快(diquat, DQ)作为一种速效除草剂广泛应用于农业[1-2],化学名称为1,10-乙烯-2,20-联吡啶阳离子,分子式为C12H10Br2N2。近年来,DQ中毒患者逐年增多,急性口服DQ中毒成为我国急诊科常见的急危重症之一。DQ通过主动或被动摄入后主要经肾脏、消化道等途径排出,在肾脏中含量最高[3-6]。临床上,DQ中毒患者可表现为肾脏、肝脏、肺脏、中枢、心脏等多器官功能损伤或衰竭,尤以肾脏损害较为突出,DQ毒代动力学及氧化还原循环反应也证实肾脏是主要排泄器官及损伤靶点[7-9]。此外,肾脏组织学分析亦表明,DQ中毒致肾损伤的主要靶点是近曲小管[10]。目前,DQ中毒的机制尚未完全明确,缺乏特效解毒剂,重症患者治疗效果欠佳、病死率高。而DQ中毒致肾近曲小管损伤可延缓毒物排泄,进一步加重全身多器官功能损伤,使患者预后更差,并发症更多[8]。因此,进一步探索DQ中毒诱导肾近曲小管损伤的机制具有重要意义,尽早改善肾功能有益于改善疾病的预后及转归。

现有研究表明,DQ中毒机制可能与氧化/抗氧化失衡、炎症反应、氧自由基损伤、细胞的网络激活及细胞凋亡等相关[1-2]。DQ作为一种强氧化剂,通过触发氧化应激产生过量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),致线粒体功能障碍,使肾近曲小管上皮细胞凋亡,进而诱导肾近曲小管细胞毒性。其中线粒体既是氧化应激后细胞内ROS的主要来源,也是ROS损害的重要靶点。过量的ROS可诱导线粒体内稳态失衡,致线粒体功能障碍[11]。相反,DQ中毒所产生的过量ROS可通过诱导线粒体膜去极化,触发线粒体自噬,以清除受损或冗余的线粒体并维持线粒体内稳态平衡,从而减轻急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)。目前,关于线粒体自噬如何减轻DQ中毒后AKI的具体机制尚未完全明确,本文作者将对线粒体自噬在DQ中毒致肾近曲小管损伤中的保护作用予以综述。

1 DQ中毒导致肾近曲小管线粒体氧化损伤

肾脏作为DQ蓄积的主要部位及排泄的主要通道,是DQ中毒的主要靶器官之一。临床上,重症DQ中毒患者往往易并发AKI,尽管现有治疗措施如血液透析等可清除毒素及水分、调节电解质平衡,从而缓解AKI,但因缺乏DQ特效解毒剂,仍有部分病人可遗留急性肾衰竭(ARF)等并发症,预后差。因此,进一步探索DQ中毒后AKI治疗的新策略有助于提高患者生存率及生活质量,减轻社会负担[12]。现有研究表明,DQ中毒致AKI可能与以下两点相关:一方面,DQ中毒诱导的氧化应激可产生过量的ROS,致线粒体功能障碍,促使肾近曲小管上皮细胞凋亡;另一方面,研究发现DQ主要蓄积于肾脏近曲小管上皮细胞,且DQ的分子结构与肾毒素(奥莱毒素)相似都具有肾脏毒性,从而致肾近曲小管功能损伤,但其具体机制有待进一步研究[12-13]。线粒体是调节细胞能量代谢平衡的关键细胞器,在细胞代谢、氧化应激、细胞凋亡中发挥关键作用[14]。线粒体作为一种防御机制,其内稳态在能量代谢中起核心作用,是细胞内ROS产生的主要来源,也是ROS损伤时作用的重要靶点[15]。DQ中毒后诱导的氧化应激致过量的ROS及活性氮(reactive nitrogen species, RNS)产生,而当线粒体内ROS累积到最大阈值时可触发线粒体内膜的阴离子通道开放,使线粒体基质释放大量ROS,导致肾近曲小管线粒体氧化损伤。由此可见,线粒体氧化损伤与DQ中毒致肾近曲小管损伤的发生密切相关。

1.1 DQ中毒诱导氧化应激及线粒体损伤

DQ中毒打破氧化还原平衡使ROS过量产生,致使肾近曲小管上皮细胞内稳态失衡,激活细胞内的炎症信号通路,诱导氧化应激,损害线粒体功能,使ROS过量产生致线粒体膜去极化,导致细胞功能障碍,DQ中毒后引起氧化应激、缺血缺氧损伤等损害肾近曲小管上皮细胞,导致其坏死,最终使肾脏排泄功能急剧下降,毒性物质进一步堆积,导致恶性循环。研究表明,氧化还原电位值(redox potential, E0)作为衡量电子亲和力的最佳指标,DQ主要以扩散的形式通过细胞膜进入肾近曲小管上皮细胞,因DQ中含有相对较高的E0,因此DQ中毒导致的氧化应激损害程度严重[16]。在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和细胞色素还原酶(P450)的作用下,DQ中毒通过氧化还原循环过程将高度不稳定DQ自由基上的电子NADP+和阳离子自由基(DQ+.)转移给分子氧(O2),产生大量超氧化物阴离子自由基(O2.+),同时DQ+.失去一个电子转化为DQ2+,通过连续不断的循环氧化还原过程产生大量的O2.+[17],与O2发生反应产生 H2O2和O2,最终使腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)合成过程中断及细胞死亡途径激活。氧化应激的重要性现已被普遍证实[18-19],是造成继发性线粒体损伤的主要原因,损伤后的线粒体使细胞内能量供应显著降低、ROS生成明显增加,两者均为加重DQ中毒后继发性肾损伤的重要因素。因此,DQ中毒引起线粒体损伤的机制与中毒诱导的氧化应激水平增强之间存在密切的关系。

1.2 DQ中毒致线粒体损伤与肾近曲小管损伤

肾脏是富含线粒体、能量消耗最高的器官之一,通过线粒体产生的ATP维持基本功能[20]。肾脏不同肾单位节段的能量需求及线粒体密度不同,其中肾近曲小管通过机体高能量供应来对抗化学梯度以发挥重吸收及分泌功能,故肾近曲小管中富含产ATP的线粒体[21]。线粒体功能障碍导致ATP生成减少、细胞结构改变、肾功能丧失,在DQ中毒肾脏疾病进展中发挥重要作用。DQ中毒所致的AKI发生率较高,肾近曲小管上皮细胞是其损伤的关键靶细胞,而线粒体损害在其间发挥重要的作用。据报道,DQ中毒后诱导氧化应激致肾近曲小管线粒体清除ROS的能力低下,致使ROS堆积,过高的ROS水平通过抑制线粒体氧化磷酸化过程下调细胞色素C(cytochrome C, cytC)氧化酶活性,最终导致线粒体功能障碍,表现为线粒体ROS生成增加、膜电位降低、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性降低、丙二醛(malondialdehyde, MDA)浓度升高[22];另外也有研究发现,DQ中毒引起的AKI可通过开放介导线粒体基质及细胞质之间的信号转导通路或物质传递的非特异通道线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability pransition pore, mPTP),进而启动线粒体通透性转变,导致氧化应激、Ca+毒性,增加促凋亡介质的释放,从而损伤线粒体功能、诱导肾近曲小管上皮细胞凋亡[21]。因此,线粒体是AKI发病机制的中心环节,线粒体损伤在DQ中毒致肾近曲小管氧化损伤中发挥重要作用。

2 线粒体损伤与线粒体自噬的相关性

线粒体损伤是DQ中毒后AKI的主要机制之一,线粒体的氧化应激、能量代谢障碍、自噬异常等是引起线粒体损伤的重要原因。线粒体自噬是巨自噬的一种,损伤的线粒体由自噬膜包裹形成自噬体,而后与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而被降解吞噬。这种方式可以保证线粒体的质量,减少损伤的线粒体释放过多的ROS、促凋亡物质等,避免对细胞造成进一步的损伤。DQ中毒诱导氧化应激致使ROS 大量聚积于线粒体内膜,导致线粒体受损及肾近曲小管上皮细胞凋亡,机体为了应对氧化应激及线粒体损伤,在线粒体膜去极化时触发了自噬。在近曲小管上皮细胞受损之前,线粒体自噬作为机体的自我防御机制,能选择性地隔离并降解掉功能失调的线粒体[23],从而阻断过量ROS的产生。线粒体自噬可通过自噬小体特异性吞噬降解受损线粒体,在维持细胞内稳态中具有重要意义。研究发现氧化应激、细胞器损伤等可通过诱导线粒体融合与裂变失衡,激活线粒体自噬,导致肾脏疾病的发生与发展[24]。因此,线粒体融合与裂变失衡是线粒体自噬发生的先决条件,线粒体自噬激活主要表现为线粒体及自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG) 上游蛋白在自噬小体形成位点处聚集,Parkin泛素化受损线粒体。泛素化的线粒体及ATG 上游蛋白与自噬小体形成位点相互作用后,受损线粒体通过微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3) 与自噬小体结合并被降解掉。线粒体自噬的激活是线粒体对氧化应激损伤的关键适应性反应,主要由受体非依赖性机制调节,该机制基于PTEN 假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)/E3泛素连接酶Parkin诱导的有丝分裂通路、Bcl-2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3/Nip3 样蛋白X通路和 FUN14结构域蛋白 1(FUN14 domain-containing protein 1, FUNDC1)通路发挥作用[25]。因此,肾组织线粒体内稳态依赖于自噬清除功能障碍线粒体。

3 线粒体自噬在DQ中毒肾近曲小管损伤中的保护作用

DQ诱导氧化应激后触发的线粒体自噬具有肾脏保护作用[26],在清除DQ诱导的受损线粒体过程中,观察到有丝分裂相关自噬蛋白的表达上调,如Pink1、Parkin、LC3-II和LC3-I表达增加[27];AKI 时近端肾小管上皮细胞中自噬现象增多,表现为自噬相关蛋白表达增多、自噬流的畅通、电镜下自噬体形成增多。证实在自我防御的基础上机体能在受损线粒体损伤肾小管之前选择性清除、吞噬功能障碍线粒体,说明线粒体自噬能对抗肾近端小管上皮细胞中的线粒体代谢应激及DQ中毒所致AKI[28],最终发挥肾脏保护的作用[29]。研究发现,在缺血再灌注肾损伤中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬增多,通过特异性敲除自噬蛋白能显著增加线粒体损伤、ROS产生,使肌酐升高、肾小管损伤评分增加、细胞凋亡增加,肾损伤明显加重[30],证实线粒体自噬在缺血再灌注损伤所致AKI的病理生理条件下,在线粒体动力学、肾小管上皮细胞及肾功能保护中扮演重要角色。激活线粒体自噬以清除受损线粒体是线粒体对DQ中毒后氧化应激损伤的关键适应性反应,FUNDC1为哺乳动物细胞内新型线粒体自噬相关受体,生理条件下,FUNDC1在肾小管中表达丰富,在介导线粒体自噬激活过程中发挥重要作用[31],FUNDC1通过LC3相互作用区(LC3-interacting region, LIR)结构域与LC3相互作用,募集自噬膜泡后包裹线粒体以选择性介导线粒体自噬。现有不少学者推论,DQ中毒致肾近曲小管线粒体功能障碍,诱导氧化应激刺激后可能通过激活FUNDC1依赖性的线粒体自噬以减轻中毒所致的AKI,可望为临床DQ中毒患者提供治疗新靶点。

4 线粒体靶向治疗及线粒体自噬在DQ中毒中的新思路

DQ中毒目前尚无特效解毒剂,故其病死率高,预后差。与PQ相比,DQ中毒后肾损害较重而肺纤维化较轻,因为DQ中毒毒性主要蓄积于肾脏。DQ中毒导致AKI,与ROS依赖性肾近曲小管上皮细胞凋亡密切相关,主要为肾近曲小管线粒体清除ROS能力低下,导致ROS累积,进而导致线粒体功能障碍。研究表明,在该过程中通过外源性补充线粒体靶向抗氧化剂-mitoTEMPO/质体醌基癸基三苯基鏻的类似物10-(6′-plastoquinonyl) decylrhodamine-19(SkQR1)能起到肾脏保护的作用[32-33]。过氧化物酶体增殖物受体共激活因子1α(proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)是线粒体生物合成的主要调节因子,高度表达于肾脏近端小管中,与其他因子共同作用促进线粒体生物合成,研究证实,肾脏中PGC-1α的表达水平与中毒后AKI的严重程度呈负相关,过表达PGC-1α-线粒体生物合成激活剂-AMPK激活剂、 AICAR、SIRT1激动剂SRT1720和白藜芦醇等,可以促进AKI的肾脏修复过程[34]。同时研究证实,中毒后线粒体裂变/融合失衡,过度裂变致使线粒体破裂,通过抑制裂变过程-线粒体裂变/线粒体自噬抑制剂(Mdivi-1)及特异性敲除肾近曲小管线粒体裂变的关键因子-线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp 1)可以保护小鼠免受DQ中毒后诱导的肾小管细胞凋亡及肾脏损害。研究发现,钙调磷酸酶抑制剂(环孢素A)(cyclosporin A, CsA)作为mPTP的强效抑制剂[35],低剂量CsA通过抑制mPTP开放,进而改善线粒体肿胀、恢复线粒体功能,从而减轻肾细胞损伤[36]。mTOR 抑制剂雷帕霉素上调自噬以减轻AKI,但具体机制尚未明确。以上结果表明,DQ中毒后通过外源性抗氧化治疗、线粒体自噬激活剂、过表达线粒体生物合成、抑制mPTP等过程的相互作用,最终减轻中毒所导致的AKI。

综上,DQ中毒诱导线粒体自噬以减轻氧化应激所致的肾脏线粒体氧化损伤,线粒体自噬的靶向抗氧化剂及促有丝分裂激动剂对DQ中毒所致的肾脏损害具有保护作用。通过自噬可以减轻DQ中毒致肾脏损害的氧化应激反应程度、修复受损线粒体形态及功能,最终改善DQ中毒的肾功能预后。应进一步探究线粒体自噬及线粒体抗氧化治疗具体机制,以期为DQ中毒致肾近曲小管损伤的合理化、规范化、系统化治疗提供临床依据。