肾移植术后BK病毒感染患者血清、尿液BK病毒DNA载量与肾功能、免疫功能的相关性

乔良伟,王凯,李明,孙东,蒋欣,曲青山

(郑州人民医院 肾移植科,河南 郑州 450000)

BK病毒(BKV)是一种多瘤病毒,成人可广泛感染,但近3/4成人存在BKV抗体,正常情况下不发病,在免疫力低下时易发病[1-3]。肾移植后免疫抑制剂的使用会导致免疫力差进而BKV易于复制,BKV大量激活可引起BK病毒相关性肾病(BKVAN),使移植肾功能出现隐匿性的损害,最终导致移植失败[4-5]。早期BKV感染症状不明显常不易发现,待BKV成千上万倍复制后会损害肾实质,此时甚至会误判为移植排斥,加大免疫抑制剂的用量,加速BKV复制以及肾损伤,BKV可存在于血液与尿液中,因此,本研究通过分析肾移植术后BKV感染患者血清、尿液标本中BKV DNA载量与患者肾功能以及免疫功能的关系,为及时发现并控制BKV复制、指导肾移植后BKV诊断与治疗、遏制肾移植的失败提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月至2022年1月在本院接受肾移植的132例患者为研究对象,其中男73例,女59例;年龄30～80(55.76±5.28)岁。纳入标准:(1) 首次接受活体或死亡者肾脏移植术;(2) 随访时间>15个月。排除标准:未能定期复查或患者死亡以及无故失访者;参与其他临床试验者。患者术前均接受抗胸腺细胞球蛋白(ATG)诱导治疗,术后常规选择环孢素A+吗替麦考酚酯+泼尼松方案。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 尿液、血清标本制备 研究对象在接受肾移植后0.5、1、3、6、9、12、15个月分别采集尿与血液标本,无菌试管收集研究对象晨起中段尿,离心弃上清,取1 ml尿沉渣在-20 ℃冷冻保存;收集患者外周血5 ml,离心,上清于-20 ℃冷冻保存。

1.2.2 尿、血BKV DNA载量测定 提取尿、血标本DNA,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法对尿、血标本进行定量。BKV引物序列:上游5′-CTGTCCCTAAAACCCTGCAA-3′;下游5′-GCCTTTCCTTCCATTCAACA-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。扩增条件为95 ℃ 2 min,95 ℃ 10 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 31 s,进行40次循环。利用OpticonMinitor软件分析结果,BKV DNA≥103copies·ml-1为阳性。其中尿BKV DNA≥103copies·ml-1为病毒尿症,血BKV DNA≥103copies·ml-1为病毒血症[6]。

1.2.3 肾功能检测 采用全自动生化分析仪检测肾功能指标肾小球滤过率(GFR)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)。

1.2.4 免疫功能测定 采用流式细胞术测定患者T淋巴细胞亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞水平,并计算CD4+/CD8+值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0对数据进行统计学分析,符合正态分布的计量资料以描述,多组间比较采用方差分析,组间有差异进一步采用SNK-q法进行两两比较。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肾移植术后BKV尿症与BKV血症发生情况

58例肾移植者尿BKV DNA阳性,即病毒尿症,发生率为43.93%(58/132);病毒尿症患者尿BKV DNA 载量中位数为3.42×105copies·ml-1(1.06×103～8.24×109copies·ml-1),根据尿BKV DNA载量分为尿BKV DNA 低载量组(1.06×103copies·ml-1≤尿BKV DNA载量<6.57×104copies·ml-1)、尿BKV DNA 中载量组(6.57×104copies·ml-1≤尿BKV DNA载量<5.58×105copies·ml-1)、尿BKV DNA高载量组(5.58×105copies·ml-1≤尿BKV DNA载量≤8.24×109copies·ml-1),并将尿BKV DNA阴性者作为尿BKV DNA阴性组。

32例肾移植者血BKV DNA阳性,即病毒血症,发生率为24.24%(32/132);病毒血症患者血BKV DNA 载量中位数为4.51×103copies·ml-1(1.21×103～9.49×106copies·ml-1),根据血BKV DNA载量分为血BKV DNA 低载量组(1.21×103copies·ml-1≤血BKV DNA载量<3.68×103copies·ml-1)、血BKV DNA 中载量组(3.68×103copies·ml-1≤血BKV DNA载量<5.24×105copies·ml-1)、血BKV DNA高载量组(5.24×105copies·ml-1≤血BKV DNA载量≤9.49×106copies·ml-1),并将血BKV DNA阴性者作为血BKV DNA阴性组。

5例肾移植者病理学活检阳性为BKV肾病,发生率为3.79%(5/132),尿BKV DNA 载量中位数为7.82×108copies·ml-1(5.61×108～8.24×109copies·ml-1),血BKV DNA 载量中位数为5.58×105copies·ml-1(3.33×105～9.49×106copies·ml-1)。病毒尿症患者发生BKV肾病率为8.62%(5/58),病毒血症患者发生BKV肾病率为15.63%(5/32)。

2.2 肾移植术后不同时间点血、尿BKV DNA载量变化

尿BKV DNA载量与血BKV DNA载量随时间变化趋势基本一致,于肾移植后6个月升至最高,随后降低,经对数转化后,尿BKV DNA高于血BKV DNA载量,二者比较差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

图1 肾移植术后不同时间点BKV DNA载量变化

2.3 不同尿BKV DNA载量者肾功能、免疫功能检测结果

尿BKV阴性组、低载量组、中载量组、高载量组CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+、GFR、SCr、BUN、Cys-C水平差异有统计学意义(P<0.05)。与尿BKV阴性组相比,尿BKV DNA低载量组、中载量组、高载量组CD4+T细胞、CD4+/CD8+水平及GFR降低(P<0.05),CD8+T细胞水平升高(P<0.05);与尿BKV DNA低载量组相比,尿BKV DNA中载量组、高载量组CD4+T细胞、CD4+/CD8+水平及GFR降低(P<0.05),CD8+T细胞水平升高(P<0.05);与尿BKV DNA中载量组相比,尿BKV DNA高载量组CD4+T细胞、CD4+/CD8+水平及GFR降低(P<0.05),CD8+T细胞水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 不同尿BKV DNA载量患者肾功能、免疫功能比较

2.4 不同血BKV DNA载量者肾功能、免疫功能检测结果

血BKV DNA低载量组、中载量组、高载量组CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+、GFR、SCr、BUN、Cys-C水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。与血BKV阴性组相比,血BKV DNA低载量组、中载量组、高载量组CD4+T细胞、CD4+/CD8+、GFR水平降低(P<0.05),CD8+T细胞、SCr、BUN、Cys-C水平升高(P<0.05);与血BKV DNA低载量组相比,血BKV DNA中载量组、高载量组CD4+T细胞、CD4+/CD8+、GFR水平降低(P<0.05),CD8+T细胞、SCr、BUN、Cys-C水平升高(P<0.05);与血BKV DNA中载量组相比,血BKV DNA高载量组CD4+T细胞、CD4+/CD8+、GFR水平降低(P<0.05),CD8+T细胞、SCr、BUN、Cys-C水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 不同血BKV DNA载量患者肾功能、免疫功能比较

2.5 尿、血BKV DNA与患者免疫以及肾功能相关性

尿BKV DNA载量与CD4+T细胞、CD4+/CD8+水平呈负相关(P<0.05),与CD8+T细胞水平呈正相关(P<0.05);血BKV DNA载量与CD4+T细胞、CD4+/CD8+、GFR水平呈负相关(P<0.05),与CD8+T细胞、SCr、BUN、Cys-C水平呈正相关(P<0.05),见表3。

表3 尿、血BKV DNA载量瘀患者免疫功能以及肾功能的相关性

3 讨 论

BKV是多瘤双链环状DNA病毒,肾移植者由于自身免疫力下降以及免疫抑制剂应用的双重作用使BKV激活较高,病毒大量复制会逐渐损害肾实质[7]。泌尿系统上皮细胞内潜伏BKV,BKV可随尿液排出,因此尿液中可测得BKV DNA,泌尿系统上皮细胞BKV的继续复制会破坏肾小管上皮细胞,致使BKV进入血液循环,血液中可测得BKV DNA[8-9],分析血液、尿液标本中BKV DNA载量,并分析BKV DNA与肾移植相关的免疫因素以及肾功能关系有助于平衡免疫抑制剂以及抗BKV病毒药物的使用。

本研究发现,132例肾移植术患者尿液BKV DNA阳性率为43.93%、血液BKV DNA阳性率为24.24%,病理证实BKV肾病5例(3.79%)。潘国政等[10]研究显示,肾移植后病毒血症、病毒肾病发生率分别为46.04%、1.31%;刘德川等[11]研究显示,肾移植术后主动监测BKV患者发生肾失功者比例为26.67%;熊睿等[12]研究显示,接受同种异体肾移植术患者尿液BKV DNA>107copies·ml-1发生率为13.4%。本研究数据与上述研究结果大致相同,提示肾移植后BKV感染较为稳定。肾功能以及免疫功能是肾移植后须重点观察的内容,BKV大量复制会影响患者肾功能以及免疫功能,值得临床重点关注[13]。本研究发现尿BKV DNA低载量组、中载量组、高载量组CD8+T细胞水平逐渐升高,而CD4+T细胞、CD4+/CD8+水平逐渐降低,提示尿BKV DNA感染程度可反映患者肾功能损伤程度,高浓度组与肾功能有相关,可能原因为高浓度尿BKV DNA存在血BKV DNA感染,影响肾功能。袁树珍等[14]研究显示,低CD4+CD25+Treg数量者发生急性肾排斥可能性较高CD4+CD25+Treg数量者高,即低水平CD4+CD25+Treg细胞不利于器官移植后的生物相融,通常会选择进行免疫抑制处理,尿BKV DNA感染时,仅有少量患者可能发生病毒肾病,可能因为大部分尿BKV DNA感染患者病毒还未侵入血液影响肾脏,未对肾脏造成损伤,此时还应该继续选择免疫抑制剂应用,避免急性排斥反应。抗BKV与免疫抑制剂的使用需要找到平衡点,选择性进行免疫抑制剂的调整。BKV病毒尿症患者BKV DNA 载量在术后6个月时达到高峰,随后下降,术后12个月后趋于平衡。

按照BKV病毒血症患者血液BKV DNA载量分组,发现低载量组、中载量组、高载量组患者CD8+T细胞水平逐渐升高,而CD4+T细胞、CD4+/CD8+水平逐渐降低,与尿液结果类似,病毒进入血液后进一步复制将有可能损伤肾组织,BKV肾病者100%来源于血BKV感染者,提示BKV的进一步复制预示着免疫功能的进一步下降,同时低载量组、中载量组、高载量组患者肾功能指标GFR水平下降,Cr、BUN、Cys-C水平升高,提示患者肾功能下降,患者可能出现了肾损伤影响到了肾功能,且BKV DNA与GFR、CD4+T细胞、CD4+/CD8+水平呈负相关,与CD8+T细胞、Cr、BUN、Cys-C水平呈正相关,提示血BKV DNA载量与免疫功能、肾功能呈负相关,BKV DNA在血液中的复制较为危险,需酌情调整肾免疫抑制剂的使用,在控制排斥反应以及抑制BKV复制间找到平衡点。5例BKV肾病患者免疫功能弱、肾功能差,因例数较少,无法分析与免疫平衡以及肾功能的相关性。

综上所述,尿BKV DNA载量与肾移植后患者免疫功能有关,高水平BKV DNA载量与肾功能有关,血BKV DNA载量与肾移植患者免疫功能、肾功能相关,得出此结论的原因可能与未单独将尿BKV DNA阳性但血BKV DNA阴性患者分离出来,未血液扩散患者并未发展至肾损伤所致。本研究也存在一定不足,未将肾抑制剂因素纳入进行综合分析,可能对结果造成一定偏倚,下一步将对此展开研究。