外泌体miRNAs 联合模型预测脑挫裂伤患者预后的临床意义*1

彭保星 张 倩 陈岩玉 应国明 胡 超

( 鄱阳县人民医院重症医学科, 江西 鄱阳 333100 )

脑外伤后患者血清的外泌体表达明显升高,因此,外泌体可作为新型的脑挫裂伤的预后指标,对脑外伤的诊断、损伤严重程度及预后评估具有较高价值[1-3]。 为探究外泌体miRNAs 联合模型预测脑挫裂伤患者预后的临床意义,本次研究选取我院2020年1 月—2022 年3 月收治的脑挫裂伤患者200 例。本次研究详细报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取我院2020 年1 月—2022 年3 月收治的脑挫裂伤患者200 例,分别检测入院时和1 周后采集患者外周血,经外泌体提取,采用RT -PCR 检测外泌体miRNAs(miR -21、miR -124、miR -335)的表达水平;根据伤后3 个月的GOS 评分分为预后良好组(GOS 4 ～5 分)与预后不良组(GOS 1 ～3 分)。 收集患者的临床诊疗和影像学资料。 上述患者须征求患者家属同意。 同时,本课题研究内容已得到医院医学伦理委员会审批(伦理审批号:PYPH202107)。一般资料对比差异无统计学意义(P＞0.05)。 见表1。 本研究的诊断与治疗标准:《脑挫裂伤诊疗指南》和《中国颅脑创伤外科手术指南—专家共识(2015版)》[4]。 (1)纳入标准:①有明显的外伤史,急诊CT有脑挫裂伤征象,按上述诊断标准确诊脑挫裂伤;②年龄18 ～70 岁,入院时患者生命体征相对稳定,无合并其他脏器损伤;③受伤后4 小时内入院。 (2)排除标准:①患有恶性肿瘤者;②因头晕等所致的头部外伤或因脑卒中致外伤者;③患有原发性脑干损伤者;④开放性颅脑损伤者;⑤入院后需急诊开颅手术者;⑥血液系统疾病,近期有感染性疾病;⑦严重复合伤,头部或身体其他部位有开放性伤口者。

表1 2 组一般资料对比(n=100)

1.2 方法

方法如下:收集2 组患者一般临床资料、神经影像学资料。 ①一般临床资料:性别、年龄、家族史、教育水平、既往病史(高血压、高血脂、糖尿病、冠心病等)、病程、个人生活习惯(吸烟、嗜酒、不合理饮食、缺乏锻炼和社会退缩)等[5-8]。 ②神经影像学资料:采用磁共振成像系统(MRI)(德国SIEMENS 公司生产,设备型号SOMATOM Definition AS)和或电子计算机断层扫描(CT)(德国SIEMENS 公司生产64 排CT)予以患者进行检查,入院时GCS 评分、挫裂伤部位、出血量、中线移位距离、脑挫裂伤体积、合并颅骨骨折例数、是否应用抗凝药物等。 (2)外周血采集与预处理。 患者入院后分别于第2 天和第7 天清晨采集患者空腹血3 mL,装入无菌EDTA 试管内,以每分钟2 500 转的速度进行离心2 分钟,取血清转移至无菌试管中。 (3)外泌体提取。 上述方法分离血清。①立即血清离心纯化:3 000 g,10 分钟,取上清液。②按比例加入提取试剂,按照外泌体提取试剂盒操作(上海联迈生物),混匀,静置30 分钟。 ③再次离心:1 500 g,30 分钟, 去上清液。 ④纯化离心:1 500 g,5 分钟,去上清液。 ⑤加入无RNA 酶的水,吹打,放于-80℃冻存,备检测用。 (4)外泌体miRNAs 的检测方法。 ①引物设计与订制:由上海生工合成,外泌体总RNA 提取:Trizol 法提取外泌体中总RNA,经检测RNA 质量检测,再RNA 浓度测定,备目标基因检测。 ②荧光RT-PCR 检测:先采用RT reagent kit 逆转录RNA 为cDNA,反应条件:42 ℃15 分钟,85 ℃5 秒。 采用SYBR 荧光RT -PCR 技术,按25 uL 反应体系,使用荧光PCR 仪进行扩增反应。反应条件:95 ℃10 分钟,95 ℃15 秒,60 ℃60 秒,40 个循环。 采用U6 作为内参,健康体检者血清为对照,用2-ΔΔCt 表示各组血清外泌体miR-21、miR-124、miR-335 的相对表达量,反应重复操作3 次。

1.3 统计学分析

应用SPSS 20.0 工具进行处理,计量资料用()表示,组间对比采用t检验;计数资料采用(n,%)表示,组间对比采用χ2检验,采用Logistic 回归模型分析外泌体miRNAs 与脑挫裂伤患者预后不良的相关性,选取LASSO 法结合相关因子构建预测模型,再绘制受试者工作特征(ROC)曲线计算该联合模型预测的敏感度和特异度,利用MedCalc 软件工作绘制森林图,P＜0.05则提示对比具有明显差异。

2 结果

2.1 2 组影像学及实验室资料对比

2 组患者入院时GCS 评分、出血量、中线移位、脑挫裂伤体积、miR -21、miR -124、miR -335 对比差异具有统计学意义(P＜0.05),2 组合并颅骨骨折例数、是否应用抗凝药物对比差异无统计学意义(P＞0.05)。 见表2。

表2 2 组的影像学及实验室资料对比(,分,n=100)

表2 2 组的影像学及实验室资料对比(,分,n=100)

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2.2 变量及赋值及多因素分析

结果表明,出血量＞12 mL、中线移位＞5 mm、脑挫裂伤体积＞20 cm2、miR -21 ＞2.5、miR -124 ＞3、miR-335 ＞2.5 是预后良好的独立影响因素,入院时GCS 评分＞8 分是预后良好的保护因素。 赋值。见表3。 多因素分析。 见表4

表3 变量及赋值

表4 多因素回归分析

2.3 森林图

利用MedCalc 软件工作绘制森林图,OR 值森林图它的中心小方块是OR 值,左右两侧的代表OR 值的波动范围,然后竖虚线可以直观地看出OR 值的95%CI 是否包含1,显然这个置信区间内是包含1的,即对应的因素不显著。 出血量＞12 mL、中线移位＞5 mm、脑挫裂伤体积＞20 cm2、miR -21 ＞2.5、miR-124 ＞3、miR -335 ＞2.5 是预后良好的独立影响因素,入院时GCS 评分＞8 分是预后良好的保护因素。 见图1。

图1 森林图

2.4 ROC 曲线图分析及ROC 曲线图

三者联合对预后良好具有较高预测价值, 灵敏度、特异度、 准确度分别为100.00%、96.00%、98.00%。 见表5、图2。

图2 ROC 曲线图

表5 ROC 曲线图分析(%)

3 讨论

外泌体是细胞分泌的一种细胞外囊泡,其内含双链DNA、编码及非编码RNA 等遗传信息和功能分子,能够通过血脑屏障,参与细胞间的通讯[9]。 国内有的学者[10]指出:外泌体可用于创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的辅助诊断以及预后的监测。

目前,研究证实针对血浆和血清外泌体miRNAs可作为TBI 的诊断指标,研究中确认了10 个能够对轻度、中度和重度TBI 进行诊断的miRNAs 序列,包括:miR-151 - 5 p、miR -195、miR -20 a、miR -328、miR-362 -3 p、miR - 30 d、miR -451、miR -486、miR-505 以及miR-92 a[11]。 有的学者总结评估TBI 患者损伤程度和预测预后有潜在价值的新型生物标志物-外泌体miRNA 后指出,miRNA -21 与miRNA-210 具有促进血管生成的作用,当组织发生缺血缺氧时,组织细胞会分泌miRNA -21 与miRNA-210,其主要作用为减少缺血缺氧部分脑细胞的凋亡和减轻其炎症反应[12-13]。 此外,在局部脑组织受到损伤后,神经细胞通过一系列细胞因子及体液介导,诱导受损部位产生免疫和炎症反应,而miRNA-21、miR-124 具有调节小胶质细胞功能的潜力,调节神经细胞的炎症反应和调亡[14-15]。 在外泌体与神经炎症的研究中,新型miR-335 参与脑缺血再灌注和脑细胞凋亡的炎症反应[16]。 目前,新型miR -335 在脑损伤中的研究较少,具有探索的价值。 本次研究中,2 组患者入院时GCS 评分、出血量、miR -21、miR-124、miR-335、中线移位、脑挫裂伤体积对比差异具有统计学意义(P＜0.05),2 组合并颅骨骨折例数、是否应用抗凝药物对比差异无统计学意义(P＞0.05)。 Cox 回归分析,出血量＞12 mL、中线移位＞5 mm、脑挫裂伤体积＞20 cm2、miR -21 ＞2.5、miR-124 ＞3、miR-335 ＞2.5 是预后良好的独立影响因素,入院时GCS 评分＞8 分是预后良好的保护因素。miR-21 ＞2.5、miR -124 ＞3、miR -335 ＞2.5 是预后良好的独立影响因素,原因在于,miR-21 ＞2.5、miR-124 ＞3、miR -335 ＞2.5 的发生会导致患者脑部联络纤维、投射纤维、联合纤维损伤,减慢其神经信号传递速度,使患者各脑区域的信息联络出现障碍,增强认知功能障碍发生风险。 脑内微出血会进一步损伤脑组织,微出血数量越多,患者的脑组织损伤就越严重,对其神经元生物电活动产生干扰,导致患者出现一系列认知功能障碍。 中线移位＞5 mm、脑挫裂伤体积＞20 cm2是预后良好的独立影响因素,因此,在脑部影像学检查中,临床必须加强此类患者的认知功能评估、影像学复查等,以对认知功能障碍的发生做到早期、准确识别,并实施针对性干预措施,以改善其预后。

综上所述,外泌体miRNAs 对于预后具有重要意义,对于指导临床治疗具有重要作用。 外泌体miRNAs 与脑损伤密切相关,不仅是脑损伤预测生物标志物,而且还是脑损伤治疗的靶点,具有广阔的应用前景。