实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品中的运用

2023-11-18张丽华

大众标准化 2023年18期

张丽华

（赤峰工业职业技术学院，内蒙古自治区赤峰 024000）

肉及肉制品在加工、储存、运输等环节都有可能被致病细菌或微生物污染。为切实保障消费者的健康安全，相关部门需要对肉及肉制品取样检测，以判断致病细菌和微生物的数量是否超过了相关标准的规定数值，如果检测结果发现致病细菌或微生物的数量超标，则不允许肉及肉制品进行销售。目前常用的细菌培养法、血清学鉴定法等检测方法，虽然也能检测出样品中致病细菌和微生物的数量，但是存在精度不够高、花费时间多等弊端。相比之下，实时荧光定量PCR技术则可以快速、准确地完成肉及肉制品中致病细菌和微生物的测定。例如，有学者使用TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR技术，直接从样品中检测呼吸道纤毛杆菌的DNA，检测用时仅为30 min。文章就实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品中的运用展开了试验分析。

1 实时荧光定量PCR技术原理

实时荧光定量PCR技术是将能够发出荧光信号的荧光基因，加入到PCR反应体系中，然后通过荧光信号的积累实现对PCR过程的动态监测，最后绘制标准曲线对未知模板展开定量分析。根据选用荧光材料的不同，具体又可以分为荧光染料和荧光探针等多种类型。这里以TaqMan探针实时荧光定量PCR技术为例，简要概述其原理。TaqMan探针实际上是单链DNA的一个片段，含有一个报告基因和一个猝灭基因。其中，报告基团位于TaqMan探针的5′端，猝灭基因则位于TaqMan探针的3′端。在PCR扩增环节，Taq酶作为一种DNA聚合酶，在具备较强活性的情况下，能够让脱氧核苷酸聚合形成脱氧核苷酸链。在这一过程中，3′→5′外切酶活性将荧光探针降解，位于探针上的报告基团也随即变成游离基团，并发出荧光信号。此时，荧光检测系统可以接收并积累荧光信号。根据荧光信号即可完成对特定物质的实时监测。

在肉及肉制品的成分检测中，研究人员通常选用线粒体D-loop区的622～704片段中的DNA链制作TaqMan探针。这时因为线粒体基因具有含量多、分裂快、灵敏度高等特点，使用这种TaqMan探针可以精确测定加工肉制品中猪肉的含量，根据检测结果可以判定是否存在猪肉掺假的情况。例如，有研究人员以超市售卖的羊肉丸作为样品，使用TaqMan探针对线粒体中的Cytb进行检测，检测出样品中猪肉含量为0.01%，说明不存在用猪肉仿冒羊肉的情况。

2 实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品污染物检测中的应用

2.1 材料与方法

2.1.1 样品来源

本次试验从农贸市场、连锁超市选取83份肉及肉制品样品，其中：牲畜类（包括生猪肉、生牛肉、生羊肉3种）样品共36份，家禽类样品共20份，鲜冻水产品15份，熟肉制品10份。

2.1.2 试验仪器与试剂

本次试验使用到的主要仪器为MX3000P型实时荧光PCR检测仪，FS-200型高速离心机。可用于检测多种常见细菌（如沙门菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌等）的Real-time Q-PCR检测试剂盒，以及显色培养基、SS平板。

2.1.3 检测方法

为了验证实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品污染物检测中的应用效果，文章设计了对照试验。对照组采用细菌培养法，测定样品中沙门菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌这4类细菌的数量。这里以沙门菌为例，培养方法为：将低温保存的菌种放到室温下进行解冻，在解冻期间将准备好的样品放入高营养、无选择性的培养基中。将解冻后的菌种放入培养基，使环境温度升高至37 ℃，提供一个有利于沙门菌复苏与生长的理想环境。然后开始增菌操作，将菌种分别转移到各自适宜的培养平板上进行增殖。设定增殖时间为24 h，之后对增殖的菌种做分纯处理，保证沙门菌的纯度。再将分纯后的细菌用生理盐水制备成菌悬液，以备鉴定使用。其他污染物的鉴定分别参照《食品卫生微生物学检验》（GB/T4789.10-2008）中的有关规定进行，不再赘述。

实时荧光定量PCR技术的检测方法如下：

（1）核酸提取。用胶头滴管吸取2.0 ml的样本增菌液，置于5 ml的灭菌EPP管中。将EPP管放入高速离心机，设定转速为12 500 r/min，离心时间为90 s，使样本增菌液充分振荡均匀。然后吸取并去掉上层清液，只保留底部沉淀。向沉淀中加入180 μl的DNA提取液，重新放入高速离心机，按照同样的参数进行处理。将混合均匀的混合物放入100℃的沸水中水浴10 min，最后置于高速离心机中，以12 500 r/min的转速处理5 min，之后吸取10 μl的上层清液，做PCR反应。

（2）PCR反应。使用实时荧光PCR检测仪进行PCR扩增检测。参照Real-time Q-PCR检测试剂盒说明书的内容，制作进行PCR反应所需的混合液，并设置循环参数。分别设定了阳性和隐性梯度模板，作为对照。

（3）特异性检测。将临床分离鉴定的沙门菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌和副溶血性弧菌，各取5株作为检测标准，分析实时荧光PCR试剂盒的特异性。

（4）参考试剂盒说明书，将阳性菌种进行10倍梯度稀释，与样本进行PCR扩增。将未进行稀释的阴性菌种以平板培养法进行扩增，两者进行对照。同时观测试剂盒的灵敏度。

2.2 肉及肉制品污染物的检测结果

2.2.1 细菌培养法检测结果

在83份肉及肉制品的样品中，共检测出6株沙门菌，阳性率为7.23%；检测出5株金黄色葡萄球菌，阳性率为6.02%；检测出2株副溶血性弧菌，阳性率为2.41%；未检测到空肠弯曲菌。

2.2.2 实时荧光定量PCR检测结果

在83份肉及肉制品的样品中，共检测出17株沙门菌，阳性率为20.48%；检测出11株金黄色葡萄球菌，阳性率为13.25%；检测出8株副溶血性弧菌，阳性率为9.64%；检测到3株空肠弯曲菌，阳性率为3.61%。

2.2.3 PCR的特异性与灵敏度

使用Real-time Q-PCR检测试剂盒对临床分离的4种细菌（各5株）进行检测，结果显示特异性均为100%，没有出现假阳性或假阴性。说明本次试验所用的Real-time Q-PCR检测试剂盒具有良好的特异性，检测结果可靠。使用实时荧光定量PCR技术对10倍梯度稀释的阳性菌种进行检测，结果显示最低可检测到100 copoes/ml浓度的核酸样本，其检测灵敏度远远高于常规的细菌培养法。

2.3 检测结果分析

对比细菌培养法和实时荧光定量PCR技术的检测结果可以发现，后者的检测精度更高。以沙门菌为例，在肉及肉制品的样品数量相同的情况下，使用细菌培养法仅检测到6株沙门菌，阳性率为7.23%；而使用实时荧光定量PCR检测，发现了17株沙门菌，阳性率为20.48%，检测精度提高了将近3倍。另外，使用常规的细菌培养法，未能从肉及肉制品的样品中检测出空肠弯曲菌；而使用实时荧光定量PCR则检测到3株空肠弯曲菌。

另外，在本次实时荧光定量PCR检测试验中，每一种肉及肉制品都发现了沙门菌。其中，牲畜类样品中检测到沙门菌8株，家禽类样品中检测到沙门菌5株，鲜冻水产品中检测到沙门菌3株，熟肉制品中检测到沙门菌1株。另外，金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的检出率也比较高，这也在一定程度上表明本地肉及肉制品的细菌和微生物污染问题比较严重，容易发生消费者食物中毒事件。基于此，有必要推广使用实时荧光定量PCR技术，快速、准确地检测出肉及肉制品中治病细菌和微生物的浓度，及时处理被污染的肉及肉制品，从而有效预防食源性疾病的发生。

3 讨论

3.1 实时荧光定量PCR技术的应用优势

肉及肉制品在加工、储藏、运输、销售等环节，都有可能受到细菌、微生物的污染。当细菌、微生物的数量达到一定程度后，即可对食用者的健康安全构成威胁。为确保食品安全，需要对肉及肉制品的污染物进行检测。常规的检测方法是细菌培养法，其操作流程包括前增菌、选择性培养基再次增菌、平板培养、菌落分离物检测等多个环节。应用细菌培养法进行肉及肉制品的污染物检测，不仅操作较为繁琐，而且需要3～5 d才能得出检测结果。这种情况下检测结果中的污染物数量，与当前肉及肉制品上污染物的数量存在明显差异，因此检测结果的参考价值不高。除此之外，由于操作过程中很难做到全程无菌，结果假阳性的情况也比较常见。

相比之下，文章所述的实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品污染物检测中则表现出明显的应用优势，主要表现为以下几点：其一，操作流程相对简便。如上所述，基于实时荧光定量PCR技术的污染物检测只需要核酸提取、PCR反应、特异性检测等几个步骤，操作十分简单；其二，使用专门的Real-time Q-PCR检测试剂盒可以快速得出沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等常见细菌的浓度，并且试验结果表明检测结果的灵敏度可以得到100 copoes/ml，完全能够满足日常肉及肉制品污染物检测的要求；其三，检测周期短，一般只需要3～5 h即可得出检测结果。近几年，随着分子信标技术的成熟发展，使得PCR技术检测污染物的效率也得到了进一步的提升。在整个检测过程中，除了增菌后需要1～2 h左右的前处理，以及1 h左右的结果分析外，试验中的其他操作只需要几分钟或十几分钟就可以完成。这样一来，就可以保证检测结果具有更高的可信度，为肉及肉制品的处理提供了数据支持和科学依据。目前，实时荧光定量PCR技术已经成为快速检测肉类、蔬菜类食品中致病细菌和微生物的一种常用检测技术。

3.2 应用实时荧光定量PCR技术的注意事项

从整体上来看，实时荧光定量PCR技术因为具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，在真假肉制品的鉴定，以及肉及肉制品治病微生物的检测等方面得到了广泛应用。但是要想真正发挥这一技术的应用优势，还必须注意以下几点：

首先，肉及肉制品的前处理是一道不能忽视的重要步骤。根据实时荧光定量PCR技术的检测原理可知，在检测样品中所有治病细菌和微生物时，无法准确区分死菌和活菌。如果将死菌也计算在内，可能会导致实际检测出的治病细菌和微生物的数量，要高于真实情况，从而导致检测灵敏度下降。通过开展肉及肉制品的前处理（如离心振荡、提取上清液等），可以有效去除样本中的死菌，从而使最终的检测结果有更高的灵敏度。

其次，必须选用正确的Real-time Q-PCR检测试剂盒，才能保证检测结果有良好的特异性。Realtime Q-PCR检测试剂盒具有很强的单一性，即每一种试剂盒只能检测出特定的某种细菌或微生物。例如，使用沙门菌核酸Real-time Q-PCR检测试剂盒，只能检测出肉及肉制品中含有的沙门菌的数量；使用金黄色葡萄球菌核酸Real-time Q-PCR检测试剂盒，只能检测出肉及肉制品中含有的黄色葡萄球菌的数量。文章主要针对肉及肉制品中的沙门菌、黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌和副溶血性弧菌4种致病细菌进行检测，因此需要准备4种相应的试剂盒。

最后，需要保证酶有较强的活性，才能提高检测结果的精确性。荧光探针虽然具有较强的灵敏性和特异性，但是探针的水解十分依赖酶的活性，两者之间为正相关。在应用实时荧光定量PCR技术时，需要选择活性较高的酶，保证荧光探针的水解更加充分、彻底，这样才能以更快的速度，得到更加精确的检测结果。