载四羧基酞菁锌明胶微球的制备及其光动力抗菌活性

李梓童，廖晓敏，许诺，徐洲，陈意，钟琴,＊，常金明,

（1.西华师范大学化学化工学院，四川 南充 637009；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；3.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川 成都 610065）

引言

细菌感染具有高发病率和高致死率，尤其是由多药耐药菌引起的细菌感染，近几十年对人类健康构成了严重威胁。病原体普遍存在的抗生素耐药性问题促使人们寻找抗生素替代疗法。与抗生素相比，基于光动力治疗的光敏剂在细菌抗感染中引起了广泛关注。抗菌光动力疗法（APDT）中，光敏剂受一定波长光照激发时跃迁至激发态，并与环境氧分子作用产生活性氧物种（ROS），例如单线态氧（1O2），从而对细菌乃至耐药菌的多个靶点产生作用，能有效灭活致病菌甚至耐药菌，显示出独特的优势，如非侵入性、远程可控、生物安全性、不产生耐药性、抗菌谱广，对多种病原微生物均有效等。因此，APDT 已成为最具前景的抗生素疗法的安全替代方法[1-2]。

随着APDT 应用的日益广泛，对光敏剂的要求也越来越高。金属酞菁作为第二代光敏剂的典型代表，生物相容性好、可修饰性强，具有良好的化学稳定性、高光敏活性、长三线态寿命，在650～750 nm的红光区具有较强吸收[3]，正好位于生物组织光学窗口（650～1 300 nm）[4]，因此经常被研究用于光动力治疗。然而，金属酞菁难溶于水，易形成面对面平行聚集（H 聚集）或错位平行聚集（J 聚集），聚集淬灭效应导致金属酞菁失去光敏活性，限制了其在富水环境中的应用[5]。将金属酞菁与亲水大分子偶联（如聚乙二醇[6]）或使用药物载体（如壳聚糖[7]、脂质体[8]、聚N-异丙基丙烯酰胺[9]等）能有效克服这一缺陷。

明胶是一种天然的生物可降解聚合物，因此明胶微球（gelatin microspheres,GMs）被作为治疗多种疾病的安全药物输送载体广泛应用[10]。明胶分子中存在较多羧基，有助于通过金属配位键与含有羧酸的分子配位偶联。本研究选用四羧基酞菁锌（TPZnPc）为模型光敏剂，通过乳化交联法，利用Cu2+与明胶和TPZnPc 中的羧基形成配位键交联，将TPZnPc 以单体形式负载到明胶中，制备负载TPZnPc 的明胶微球（TPZnPc-GMs），如图1。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR） 和扫描电子显微镜（SEM）对其形貌及结构进行表征，利用紫外-可见（UV-Vis）光谱对其光敏剂载药量、聚集状态、1O2的产生进行了考察。此外，以革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌为指示菌，通过生长曲线法评估了TPZn-Pc-GMs 的光动力抗菌活性。

图1 TPZnPc-GMs 的制备过程和结构示意图Fig.1 Schematic preparation procedure and structure of TPZnPc-GMs

图2 GMs（A）、Cu-GMs（B）和TPZnPc-GMs（C）的FT-IR 光谱图Fig.2 FT-IR spectra of GMs (A), Cu-GMs (B) and TPZnPc-GMs (C)

图3 GMs(a),Cu-GMs(b)和TPZnPc-GMs(c)的SEM 照片及粒径分布图（插图为对应产品的数码相片）Fig.3 SEM images and particle size distributions of GMs (a), Cu-GMs (b) and TPZnPc-GMs (c) (The insets are digital photos of the corresponding products)

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

N,N-二甲基甲酰胺溶液（DMF）、无水乙醇、液体石蜡、石油醚，分析纯，成都市科隆化学品有限公司；司班80（span-80）、异丙醇、25%戊二醛，分析纯，上海阿达玛斯试剂有限公司；营养肉汤（NB），生化级，北京沃凯生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌（B. subtilis，ATCC6633），上海保藏生物技术中心；1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF），成都润泽本土化工有限公司。TPZnPc 由实验室合成（结构如图1）,400 MHz 核磁共振氢谱（1H NMR，d6-DMSO）数据为:δ=11.39(s,1H),8.07-7.99(m,2H), 7.88 (d,J=8.2 Hz,1H),7.47(dd,J=8.2,2.3 Hz,1H),7.39(d,J=2.2 Hz,1H),7.29-7.18(m,2H)。

1.1.2 主要仪器

BRUKER AscendTM 400 MHz 超导NMR 仪，德国Bruker 公司；Nicolet 6700 FT-IR 仪，美国ThermoScientific 公司；UV-2550 UV-Vis 分光光度计，日本Shimadzu 公司；Apreo 2C SEM，美国赛默飞公司；集成LED 红外光灯（630～710 nm，50 W），深圳市优晶光电有限公司；HN-25BS 电热鼓风恒温培养箱，北京市恒诺利兴科技有限公司；LGJ-18 普通型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 微球的制备

微球采用改进的乳化交联法制备[11-12]，具体流程如图1。首先，在50 ℃下将3 g 明胶搅拌溶解于20 mL 超纯水中，随后滴加8 mL TPZnPc DMF 溶液（含0.3 g TPZnPc）并充分混合。然后，加入100 mL预热至50 ℃的液体石蜡（含体积分数1.5%SPAN-80），搅拌乳化60 min 后，滴加10 mL CuCl2溶液（0.5 mol/L），并加入0.1 mL 戊二醛（体积分数25%）溶液，175 r/min 下搅拌反应24 h 后，冰水浴降温至4 ℃固化24 h。最后，用100 mL 乙醇破乳，所得固体沉淀用异丙醇、石油醚洗涤后，进行冷冻干燥，得到绿色的TPZnPc-GMs 粉末，共2.3 g。为了对照，按照上述方法制备了不含TPZnPc 但含有铜离子和戊二醛交联的明胶微球（Cu-GMs），以及戊二醛交联的空白明胶微球（GMs）。

1.3 测试与表征

按照1∶100 的比例将微球和KBr 混合研磨，直到没有晶体反光。然后，在0.1 MPa 压力下将粉末压成透明薄片，在常温下进行FT-IR 测试，扫描范围为4 000～500 cm-1。用毛细玻璃管取少量明胶微球黏附于导电胶上（0.3 cm×0.3 cm），用SEM 对明胶微球进行形貌观察，采用Nano Measurer 软件对微球粒径进行分析统计。

1.4 TPZnPc-GMs 微球载药量测定

TPZnPc-GMs 载药量反映TPZnPc 与微球总质量之比。首先，测定梯度浓度TCPZnPC DMF 溶液的UV-Vis 光谱，对其特征吸收峰进行拟合得标准工作曲线。配制浓度为0.8 g/L 的TPZnPc-GMs 和Cu-GMs DMF 溶液，以Cu-GMs DMF 溶液为背景，测定TPZnPc-GMs DMF 溶液的UV-Vis，根据TPZnPc-GMs DMF 溶液中TPZnPc 的特征吸收峰吸光度计算出TPZnPc-GMs 溶液中TPZnPc 的实际含量，根据公式（1）求TPZnPc-GMs 的实际载药量。

式中：LE表示TPZnPc-GMs 中TPZnPc 的载药量百分数；We表示包封于TPZnPc-GMs 内TPZnPc的质量；Wm表示TPZnPc-GMs 的总质量。

1.5 TPZnPc 聚集状态测定

TPZnPc 特征吸收峰可用于判断TPZnPc 在溶液中的聚集情况。当TPZnPc 产生H 聚集，吸收峰发生蓝移；当产生J 聚集，吸收峰发生红移；高度聚集还会导致吸收峰严重的宽化。配置0.4 g/L TPZn-Pc-GMs、2 μmol/L TPZnPc 水溶液和 2 μmol/L TPZnPc DMF 溶液备用，然后在光程为1 cm 的石英比色皿中进行UV-Vis 采集，对比样品的特征吸收峰，表征TPZnPc 在水溶液中的分散性。

1.6 单线态氧测定

以DPBF 为指示剂测定单线态氧（1O2）的产生。配置DPBF（120 μmol/L）、TPZnPc（4 μmol/L）、TPZn-Pc-GMs（0.8 g/L）、Cu-GMs（0.8 g/L）和GMs（0.8 g/L）DMF 溶液备用。首先，避光条件下将DPBF 和TPZnPc、TPZnPc-GMs、Cu-GMs 和GMs 溶液等体积混合，所得混合液分别用集成LED 红外光灯（630～710 nm,50 W）照射，记录在不同照射时间（0～90 s）下DPBF 的UV-Vis 特征吸收峰值（415 nm）的变化。

1.7 光动力抗菌实验

将B.subtilis的单细菌分散液在恒温培养箱中（37 ℃）培养活化过夜，活化好的B. subtilis细菌分散液用无菌水稀释，将其OD600值调为0.05 备用。取OD600=0.05 的菌液50 mL 分别与50 mg GMs、Cu-GMs、TPZnPc-GM 及150 mg TPZnPc-GM 混合，置于有循环水浴的夹套烧杯中，用集成LED 红外光灯（630～710 nm，50 W）照射20 min，然后转移至锥形瓶封口后放置于25 ℃的恒温振荡器中培养，间隔1 h 取样，测定并记录样品的OD600值，并以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制B.subtilis的生长曲线。由稳定期OD600计算细菌存活率，存活率等于实验组OD600除以空白组OD600。实验中，不添加任何样品的菌液为空白对照，避光组作为阴性对照。

2 结果与讨论

2.1 FT-IR 分析

图 2 为 GMs、Cu-GMs 和 TPZnPc-GMs 的FT-IR 光谱图。这些光谱均出现了明胶酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带的特征吸收峰。其中，3 420 cm-1为A 带的N-H 伸缩振动峰；2 965 cm-1和2 926 cm-1为酰胺B 带亚甲基的C-H 反对称伸缩振动峰；1 640 cm-1对应酰胺Ⅰ带C=O 伸缩振动峰；1 540 cm-1对应酰胺Ⅱ带的N-H 面内弯曲振动与具有双键性质的C-N伸缩振动耦合峰；1 240 cm-1对应酰胺Ⅲ带的N-H弯曲振动和C-N 伸缩振动峰[13]。在GMs 中，羧基的-OH 伸缩振动峰出现在1 400 cm-1。然而，在Cu-GMs 和TPZnPc-GMs 中，羧基中的H+被Cu2+取代后，金属离子与羧基结合形成新的配位键，导致1 400 cm-1处羧基的-OH 吸收峰变弱甚至消失[14]。此外，Cu-GMs 和TPZnPc-GMs 在590 cm-1出现了Cu-O 键的吸收峰[15]，TPZnPc-GMs在663 cm-1出现了TPZnPc 的苯环C-H 面外弯曲振动峰[16]。这些结果证实Cu-GMs 和TPZnPc-GMs 中Cu 离子与羧基发生了配位，并且TPZnPc 成功负载在TPZnPc-GMs上。

2.2 微球形貌分析

图 3 为 GMs、Cu-GMs 和TPZnPc-GMs 的SEM 和粒径分布图。如图所示，干燥的GMs、Cu-GMs和TPZnPc-GMs 是比较规则的球体。Nano Measurer 软件对微球的粒径分析结果表明，GMs 和TPZn-Pc-GMs 平均粒径较为接近，分别为（2.6±1.3）μm、（1.6±1.0）μm，且粒径分布较窄；相较而言，Cu-GMs平均粒径较大，为（7.9±2.7）μm，粒径分布更宽。Cu-GMs 球形规则性稍差和粒径偏大可能是因为Cu2+与明胶分子两两配位造成分子间缠绕，不利于戊二醛交联成球。加入的TPZnPc 与明胶分子竞争配位，降低了这一负面影响；同时，少量明胶分子和TPZnPc 与Cu2+相互配位形成了更小的微球，造成TPZnPc-GMs平均粒径小于GMs。插图展示了干燥GMs、Cu-GMs 和TPZnPc-GMs 的数码相片，戊二醛交联的GMs 为淡黄色，引入Cu2+的Cu-GMs 为浅蓝色，负载TPZnPc 的TPZnPc-GMs 则为绿色。

2.3 微球载药量

酞菁及其衍生物具有两个特征UV-Vis 吸收谱带[17]：近紫外区的B带（300～400 nm）和可见-近红外区的Q带（600～800 nm）。图4（a）显示了TPZnPc的300～800 nm UV-Vis 吸收光谱，其B带吸收出现在308 nm，Q带吸收出现在676 nm。根据不同浓度TPZnPc 在676 nm 处的吸光度，绘制吸光度-浓度曲线图。对实验数据进行线性拟合得到方程y=0.0073x，相关系数为0.99。将图4（b）中0.8 g/L TPZnPc-GMs 溶液在676 nm 吸光度值代入上式，可得溶液中TPZnPc 浓度约为4 μmol/L，根据式（1）计算出实际载药量质量分数为0.6%。

图4 梯度浓度TPZnPc DMF 溶液的UV-Vis 光谱（插图为676 nm 处的吸光度与TPZnPc 浓度的标准曲线）（a）和0.8 g/L TPZnPc-GMs DMF 溶液UV-Vis 光谱图（b）Fig.4 UV-Vis spectra of TPZnPc in DMF with gradient concentrations (a. The inset is the standard curve of TPZnPc at 676 nm) and 0.8 g/L TPZnPc-GMs in DMF (b)

2.4 单线态氧的测定

将DPBF 与TPZnPc-GMs DMF 溶液在避光条件下混合后用集成LED 红外光灯（630～710 nm，50 W）照射（样品距光源20 cm），每10 s 记录一次UV-Vis光谱，分析DPBF 特征吸收峰（415 nm）处吸光度的变化情况来反映1O2的产率，结果见图5。单纯DPBF 的吸光度不受光照影响；对比图5 中a、b、c可知，对于没有负载TPZnPc 的GMs、Cu-GMs，DPBF 吸光度在光照前后没有明显变化；对于TPZn-Pc-GMs 溶液，DPBF 吸光度在光照后显著降低，说明溶液中产生了1O2，随着照射时间的增加，DPBF 吸收值的减少值逐渐变小。与游离TPZnPc相比（图5（d）），TPZnPc-GMs溶液中DPBF 吸光度值降低偏少，降低速度更慢，这可能是因为TPZnPc 被包裹在微球内部，光照后产生的1O2需要扩散出微球与溶液中的DPBF接触，其扩散时间＞1O2半衰期，造成DPBF 结合的1O2减少。

图5 不同时间间隔红外光LED 照射对加有DPBF 的GMs 溶液（a）、加有DPBF 的Cu-GMs 溶液（b）、加有DPBF 的TPZnPc-GMs 溶液（c）UV-Vis 光谱的影响和DPBF 溶液At/A0 与光照射时间关系图（d）Fig.5 Effect of different time intervals of infrared LED light irradiation on the UV-Vis spectra of GMs solution with DPBF (a), Cu-GMs solution with DPBF (b), TPZnPc-GMs solution with DPBF (c) and the At/A0 of DPBF solution versus light irradiation time (d)

2.5 TPZnPc 聚集状态

酞菁及其衍生物UV-Vis光谱Q带吸收峰常用于判断酞菁化合物在溶液中是否形成聚集体[18]。与大多数酞菁化合物类似，TPZnPc 在极性溶剂如DMF 中溶解性较好，不易聚集。因此，实验测定了TPZnPc 水溶液、TPZnPc DMF溶液、TPZnPc-GMs 微球溶液的UV-Vis 光谱。如图6 所示，观察到TPZnPc 水溶液的Q带向更高频率的宽化和强烈分裂，具有H 型聚集的特征[19]。然而， 当TPZnPc 负载在TPZnPc-GMs 微球中时，其Q带峰形尖锐，强度增加，没有明显的分裂，与TPZnPc DMF溶液的Q带一致。结果表明，成功制备了TPZn-Pc-GMs，且其中的TPZnPc 分子保持单体状态。

图6 TPZnPc DMF 溶液、TPZnPc 和TPZnPc-GMs 水溶液的UV-Vis 光谱Fig.6 UV-Vis spectra of TPZnPc in DMF, TPZnPc and TPZnPc-GMs in water

2.6 TPZnPc-GMs 的光动力抗菌活性

含有1 mg/mL GMs、Cu-GMs、TPZnPc-GMs 和3 mg/mL TPZnPc-GMs 的B.subtilis混合溶液在避光或光照条件的细菌生长曲线见图7，其中单纯菌液为空白对照。图7a 表明，在避光条件下，GMs、Cu-GMs 和TPZnPc-GMs 处理的细菌生长几乎不受影响。对比空白组，加入微球样品后，生长曲线稳定期OD600略有降低，可能是因为部分细菌被吸附聚集在微球表面，导致溶液中菌落数略有减少。如图7b 所示，光照后，空白组、GMs 和Cu-GMs 处理的细菌生长几乎不受影响，表明光照不影响细菌的生长。然而，光照后，1 mg/mL TPZnPc-GMs 处理的细菌生长受到明显抑制，3 mg/mL TPZnPc-GMs 处理的细菌没有生长。根据稳定期OD600计算的存活率（图c）可以得出，1 mg/mL TPZnPc-GMs 的光动力抑菌率约为65%，3 mg/mLTPZnPc-GMs 光动力抑菌率可达100%。结果表明，实验制备的TPZnPc-GMs 具有良好的光动力抗菌效果。

3 结论

通过油包水乳化交联法，利用Cu2+与羧基形成配位键交联，成功将TPZnPc 负载到明胶微球中制备了TPZnPc-GMs。研究发现，干燥的TPZnPc-GMs是绿色粉末，其微球粒径均匀，平均直径为1.6 μm。TPZnPc 负载量质量分数为0.6%，在微球中以单体形式存在，解决了TPZnPc 的低溶解性和聚集性问题，防止了TPZnPc 的自猝灭。在红光照射下，TPZnPc-GMs 溶液能有效产生1O2，发挥光动力抗菌作用，在生物医用抗菌领域具有潜在的应用前景。