表面活性剂对胰蛋白酶基本性质及制革软化效果的影响

刘昊，宋映，曾运航,2＊，石碧，2

（1.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065；2.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川 成都 610065）

前言

胰酶（从动物胰脏中提取制得，是胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等的混合物，主要组分为胰蛋白酶）用于制革软化已有上百年的时间[1-6]，它可以进一步去除皮内对制革无用的非胶原蛋白质组分，适当松散胶原纤维，使成革柔软、粒面平细、透气性和卫生性能更好[7]。然而，酶软化加工稍有不慎就可能损伤皮胶原纤维，造成伤面、松面等软化缺陷，降低皮革产品质量，损害企业经济效益。究其原因，一方面是由胰蛋白酶催化作用的相对专一性（不是绝对专一性）造成的[8]。虽然胰蛋白酶可以特异性地断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基端肽键[9]，但对于不同的蛋白质底物而言，基本都含有这类肽键，因此蛋白酶具有同时水解多种蛋白质的能力，可以同时水解非胶原蛋白质和胶原，仅是对非胶原蛋白质和胶原的亲和力、水解效率等有所不同。另一方面，皮革结构复杂[10]，且酶分子相比其他皮革化学品分子质量更大，胰蛋白酶要在制革过程中渗透裸皮并对各层级胶原纤维产生均匀作用难度很大，因此皮表层的胶原纤维比中间层受到的酶解时间更长、作用强度也更高[11]。此外，工业生产时每个转鼓或划槽中加工的皮革多达上百张，每张皮革所需的酶渗透时间和实际受到的酶作用时间更是不同。长时间的渗透和作用，使得具有高催化效率的胰蛋白酶容易误伤某张或某部位皮革的表层胶原纤维，降低产品品质。由此可见，酶分子在皮中传递慢、渗透难，是软化容易产生伤面、松面等缺陷的一个关键原因。解决制革过程胰蛋白酶传递速度慢而水解效率高的突出矛盾，则无疑对避免软化缺陷、实现高质量制革具有重要意义。

生产实践及我们的前期研究均表明酶相对分子质量越小、皮革越薄且胶原纤维分散程度越高、酶用量越多、加工温度越高，蛋白酶在皮革内传递越快[12-14]。但是，相比于大多数的蛋白酶（相对分子质量30～50 kDa），胰蛋白酶的相对分子质量（23 kDa）已经较小，再创制分子质量更小的蛋白酶难度较大。而且，基于皮革本身的组织特点和皮革产品的性能要求，脱灰裸皮厚度及纤维分散程度一般相对固定，不宜大幅改变。另外，增加酶用量或升高温度虽然能提升酶促反应速率，却更容易破坏皮的表面。因此，上述方式均不是理想的酶传质强化措施。

表面活性剂是一类重要的化工材料，种类繁多，其分子结构大多是由极性的亲水基团和非极性的疏水基团共同构成[15]，能在较低浓度下显著改变表/界面性质从而调控在界面上发生的物理化学过程[16]。日常生活及工农业生产中，表面活性剂的应用十分广泛，例如：具有增溶特性的表面活性剂可以用于清洁去污[17]；具有乳化作用的表面活性剂可以用于增强乳液体系的稳定性[18]；具有强烈杀菌效果的表面活性剂可以用于消杀体系[19]。事实上，在制革软化过程中，正是利用了表面活性剂良好的润湿性，来促进皮化材料的渗透，缩短操作时间[20-22]。过去，关于表面活性剂在制革酶处理过程中的研究主要集中在探索表面活性剂如何影响酶本身的性质（特别是催化活性）以及酶处理皮革的宏观效果。例如，李艳红等人[23]报道了非离子型表面活性剂AT80、TO10、TO40、XL90 和XP90，以及阴离子型表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（AES）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、PS65 和ABO对中性细菌蛋白酶AX、碱性细菌蛋白酶PY 等蛋白酶水解胶原和弹性蛋白的影响；左秋等人[24]报道了阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵、阴离子表面活性剂SDBS 和非离子表面活性剂平平加O对胰蛋白酶和AS1.398 酶活力的影响，以及在酶软化过程中加入上述三种表面活性剂对皮革物理性能的影响。然而，表面活性剂的主要作用之一应该是降低溶液的表面张力，提升其润湿性，加快皮化材料在介质中的传递，那么表面活性剂促进酶渗透的效果到底如何？各种表面活性剂强化酶传质的效果是否存在差异？尚缺乏系统的认识。

针对上述问题，本文首先研究了阴离子型表面活性剂顺丁烯二酸二仲辛酯磺酸钠（渗透剂T）、SDBS、AES、SDS 和非离子型表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚（JFC-1）、脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO-9）对胰蛋白酶的催化活性、表面张力、分子尺寸等的影响。然后在此基础上，采用荧光示踪技术研究了优选的表面活性剂对软化过程胰蛋白酶在裸皮内传质行为的影响规律，并通过测定软化浴液的蛋白质和羟脯氨酸浓度以及坯革的物理性能，评价了优选表面活性剂对酶软化效果的影响，以期为科学地选择和应用表面活性剂来缓解制革过程酶传质慢而反应快的矛盾，进而实现高质量的软化提供指导。

1 实验部分

1.1 主要材料与试剂

胰蛋白酶（来源于牛胰脏，生化级），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；渗透剂T、AES、AEO-9，购自成都欧恩瑞思化学试剂有限公司；SDS，购自美国Amresco 公司；JFC-1，购自江苏省海安石油化工厂；SDBS、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、L-酪氨酸、无水碳酸钠、三氯乙酸、硼酸，购自成都金山化学试剂有限公司；冰乙酸、磷酸、福林试剂（化学纯）、干酪素（化学纯），购自成都市科隆化学品有限公司；荧光素异硫氰酸酯异构体I 标记的胰蛋白酶（FITC-trypsin）按课题组前期报道的方法制备[25]；脱灰裸皮（pH 8.5，厚度约2 mm），按照常规盐湿牛皮制革工艺制备。以上试剂除特别说明的，其余均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

UV-1800PC 型紫外-可见分光光度计（上海美谱达公司）；Omni 型多角度粒度及高灵敏Zeta 电位仪（美国布鲁克海文仪器公司）；DSA25 型接触角测量仪（德国克吕士科学仪器有限公司）；DZKW-4 型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；CM1950 型冷冻切片机（德国徕卡公司）；DMi8 型倒置荧光显微镜（德国徕卡公司）；AI-7000S 型伺服控制计算机系统拉力试验机（高铁检测仪器公司）；GT-303 型皮革软度测试仪（高铁检测仪器公司）；GX-5071-A 型皮革崩裂试验机（东莞市高鑫检测设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 胰蛋白酶性质的测定

1.3.1.1 胰蛋白酶活力的测定

用Britton-Robinson 缓冲液配制pH 8.5、胰蛋白酶质量浓度0.1 g/L、表面活性剂质量浓度Xg/L（X=0、0.05、0.1、0.25、0.5）的胰蛋白酶溶液，以及pH 8.5、质量浓度20 g/L 的酪蛋白溶液。取1 mL 胰蛋白酶溶液和1 mL 酪蛋白溶液，混匀后于30 ℃反应10 min，然后加入2 mL 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液终止反应，过滤；取1 mL 滤液，加入5 mL 0.4 mol/L 碳酸钠和1 mL 稀释的福林试剂，混匀后于40 ℃显色20 min；最后，使用紫外-可见分光光度计于660 nm处测定溶液的吸光度，并按照行业标准QB/T 1803-1993《工业酶制剂通用试验方法》的附录A[26]计算溶液的酶活力，以及根据式（1）计算相对蛋白酶活力。

1.3.1.2 胰蛋白酶溶液表面张力的测定

用Britton-Robinson 缓冲液配制pH 8.5、胰蛋白酶质量浓度1 g/L、表面活性剂质量浓度Xg/L（X=0、0.5、1、2.5、5）的胰蛋白酶溶液。将上述酶溶液于30 ℃保温5 min，用接触角测量仪测定表面张力。

1.3.1.3 胰蛋白酶溶液Zeta 电位和粒径的测定

用Britton-Robinson 缓冲液配制不同pH、胰蛋白酶质量浓度1 g/L、表面活性剂质量浓度Xg/L（X=0、0.5、1、2.5、5）的胰蛋白酶溶液。将上述酶溶液于30 ℃保温5 min，用多角度粒度及高灵敏Zeta 电位仪测定上述溶液的Zeta 电位值，并测定pH 8.5 时的粒径分布。

注：1.3.1 节中所述表面活性剂包括渗透剂T、SDBS、AES、SDS、JFC-1 和AEO-9 共6 种表面活性剂。

1.3.2 胰蛋白酶的软化效果评价

1.3.2.1 接触角测定

将脱灰裸皮冷冻干燥后得到待测皮样，用接触角测量仪测定1.3.1.2 所述酶溶液与待测皮样的接触角。

1.3.2.2 胰蛋白酶在裸皮中渗透情况的分析

取脱灰裸皮，用以下工艺进行软化：温度30 ℃，液比1.0，同时加入0.1%FITC-trypsin 和0.25%表面活性剂（以脱灰裸皮质量为基准），软化5、10、15、20、30、45、60、75、90、120、150、180、240 和360 min后，用冷冻切片机切取厚度20 μm 的皮样纵剖面组织切片，并用荧光显微镜观察切片，之后用Image J软件分析荧光显微照片，并按式（2） 计算FITC-trypsin 在皮中的渗透率。

1.3.2.3 软化浴液中蛋白质浓度和羟脯氨酸浓度的测定

取脱灰裸皮，用以下工艺进行软化：温度30 ℃，液比1.0，同时加入0.1%的胰蛋白酶和X%的表面活性剂（X=0、0.05、0.1、0.25），软化15、30、45、60 和90 min 后，用文献所述方法[27-28]测定软化浴液中蛋白质和羟脯氨酸的浓度。

1.3.2.4 坯革物理性能的测定

按常规制革工艺进一步处理1.3.2.2 得到的软化裸皮，制得经浸酸、鞣制、复鞣、染色、加脂、干燥后的坯革。在20 ℃和65%相对湿度下恒温恒湿处理坯革24 h 后（ISO 2418: 2002），测定坯革的柔软度（ISO 17235: 2015）、撕裂强度（ISO 3377e2:2002）、抗张强度（ISO 3326: 2011）和崩裂强度（ISO 3359:2015）。

注：1.3.2 节中所述表面活性剂包括SDBS、AES、JFC-1 和AEO-9 共4 种表面活性剂。

2 结果与讨论

2.1 表面活性剂对胰蛋白酶基本性质的影响

本节系统研究了阴离子型和非离子型表面活性剂对胰蛋白酶催化活性、带电状态、表面张力、分子尺寸等的影响。6 种表面活性剂对胰蛋白酶活力的影响如图1a 所示。渗透剂T、SDBS、AES 和SDS会不同程度地降低胰蛋白酶活力。其中，SDS 对胰蛋白酶活力的抑制作用最强，当SDS 的质量浓度为0.25 g/L 时，胰蛋白酶基本失活。JFC-1 和AEO-9 则基本不会改变胰蛋白酶的酶活力。这可能是因为阴离子型表面活性剂渗透剂T、SDBS、AES 和SDS 会改变胰蛋白酶的电荷性质（增加了胰蛋白酶分子的表面负电荷，图1b），进而影响酶活性中心与底物的结合或催化，但非离子型表面活性剂JFC-1 和AEO-9 对胰蛋白酶的电荷性质影响很小（图1b）。

图1 表面活性剂对胰蛋白酶活力(a)、溶液Zeta 电位(b)和表面张力(c)的影响Fig.1 Effects of surfactants on the proteolytic activity of trypsin(a),Zeta potential of trypsin solution(b)and surface tension of trypsin solution(c)

如图1c 所示，6种表面活性剂均能大幅降低胰蛋白酶溶液的表面张力，其中渗透剂T 和JFC-1 的效果更佳。渗透剂T 和JFC-1 的质量浓度为0.5 g/L 时，胰蛋白酶溶液的表面张力分别降低了51%和46%，继续增加渗透剂T或JFC-1 的浓度，胰蛋白酶溶液的表面张力不再下降。而当SDBS 质量浓度高于2.5 g/L 时，胰蛋白酶溶液的表面张力才不再下降。这应该是因为SDBS 的蛋白质饱和点（PSP）质量浓度在1.0～2.5 g/L，而其它5 种表面活性剂的PSP 质量浓度均在0.5 g/L 以下。

如表1 所示，加入渗透剂T 时，酶溶液的粒径显著增加（有效直径大于280 nm），这是因为此时胰蛋白酶溶液中产生了明显的聚集现象。该现象产生的原因可能是渗透剂T 具有良好的吸附和聚集特性，能使胰蛋白酶分子大量聚集形成胶束。加入JFC-1时，胰蛋白酶溶液的粒径增至11.20～14.26 nm，这可能是因为胰蛋白酶非活性区域氨基酸残基上的H原子，如丝氨酸残基侧链羟基的H 原子、赖氨酸残基侧链ε-氨基的H 原子等，能与JFC-1 分子中醚键的O 原子形成氢键，使胰蛋白酶与JFC-1 形成了缔合体；其他4 种表面活性剂对胰蛋白酶分子尺寸的影响较小。

表1 表面活性剂存在时胰蛋白酶溶液的粒径Tab.1 Particle size of trypsin solution in the presence of surfactant

2.2 表面活性剂对胰蛋白酶软化效果的影响

根据上述6 种表面活性剂对胰蛋白酶酶活力、表面张力和分子尺寸的影响结果，下面选择SDBS、AES、JFC-1 和AEO-9 四种表面活性剂，进一步探究阴离子型和非离子型表面活性剂对制革软化过程蛋白酶传质行为、软化效果和皮胶原纤维水解程度的影响规律，以期为合理选择和科学应用表面活性剂进行软化提供指导。

2.2.1 表面活性剂对胰蛋白酶传质行为的影响

通过荧光示踪技术观察制革软化过程中胰蛋白酶在裸皮内的分布随时间的变化情况（图2），研究了表面活性剂对制革过程蛋白酶传质行为的影响。结果表明，软化20 min 内胰蛋白酶的渗透率呈现出线性增长趋势；在不添加表面活性剂的情况下，需要240 min 渗透率才能达到100%，而加入表面活性剂后，只要60 min 渗透率即可达到100%（图3a）。由此可见，在软化过程中添加SDBS、AES、JFC-1 和AEO-9 均显著促进了胰蛋白酶的渗透。这是因为这4 种表面活性剂减小了胰蛋白酶溶液的表面张力（图1c），使酶溶液与裸皮粒面的接触角从91°降至约65°（图3b），胰蛋白酶更容易渗入皮中。

图2 软化裸皮纵剖面的荧光显微照片（标尺500 μm）Fig.2 Fluorescence micrographs of vertical sections of bated hides (scale bar, 500 μm)

图3 (a)软化过程表面活性剂对胰蛋白酶在裸皮中渗透率的影响；(b)表面活性剂对胰蛋白酶溶液与脱灰裸皮粒面接触角的影响Fig.3 (a)Effect of surfactant on the penetration rate of trypsin in hide during bating process;(b)Effect of surfactant on the contact angle between trypsin solution and grain surface of delimed hide

进一步分析软化初始阶段胰蛋白酶的渗透动力学曲线，可以看出曲线斜率由大到小为AES-胰蛋白酶＞AEO-9-胰蛋白酶＞SDBS-胰蛋白酶＞JFC-1-胰蛋白酶＞胰蛋白酶，这说明4 种表面活性剂促进酶渗透的效果由强到弱为AES ＞AEO-9＞SDBS＞JFC-1。当4 种表面活性剂的质量浓度为2.5 g/L 时，胰蛋白酶溶液的表面张力（图1c）以及酶溶液与裸皮的接触角（图3b）均相似，但胰蛋白酶溶液的粒径由小到大为AES-胰蛋白酶＜AEO-9-胰蛋白酶＜SDBS-胰蛋白酶＜JFC-1-胰蛋白酶（表1）。由此可以推测，软化过程中当酶溶液的表面张力接近时，酶的渗透速率与其分子尺寸负相关（图4），这与我们的前期研究结果（软化过程相对分子质量小的蛋白酶明显渗透更快[12]）也是一致的。另外，与使用非离子型表面活性剂相比，使用阴离子型表面活性剂时胰蛋白酶的渗透速率略高，其原因应该是阴离子型表面活性剂SDBS 和AES 增加了胰蛋白酶分子表面的负电荷量（图1b），这有助于增加酶分子与皮表面（带负电荷[29]）的静电斥力，从而减小了蛋白酶与皮表面（底物）的亲和力，促进了胰蛋白酶更快地渗入裸皮内部[30-31]。

图4 软化过程胰蛋白酶在裸皮中的传质示意图Fig.4 Schematic mass transfer of trypsin in hide during bating process

2.2.2 表面活性剂对胰蛋白酶软化性能的影响

软化工序的主要目的是用蛋白酶水解去除皮中的非胶原蛋白质、松散胶原纤维，同时需要保护胶原纤维不受到损伤。因此，我们通过检测软化浴液中总蛋白质和羟脯氨酸（胶原的特征氨基酸）的浓度，分别评价了胰蛋白酶的软化效果及其对皮胶原纤维的损伤程度。此外，还测定了坯革的物理性能以进一步评价软化效果。

如图5 和图6 所示，使用表面活性剂后，软化浴液的总蛋白质质量浓度增加而羟脯氨酸质量浓度降低，这说明表面活性剂提高了软化效果，同时减少了皮胶原纤维的损伤。产生该现象的原因应该是表面活性剂缩短了胰蛋白酶在裸皮表层的滞留时间，从而减少了胰蛋白酶对皮表层胶原的水解程度。表2 中的数据表明，加入表面活性剂软化制得的坯革的物理性能优于只用胰蛋白酶软化的坯革。这也是由于表面活性剂的加入可以减少软化过程胰蛋白酶对裸皮表层胶原的损伤，同时提高胰蛋白酶在裸皮中的分布均匀性及其对裸皮各层胶原纤维的分散均匀性。

图5 表面活性剂对软化浴液总蛋白质浓度的影响Fig.5 Effect of surfactant on the total protein concentration of bating float

图6 表面活性剂对软化浴液羟脯氨酸浓度的影响Fig.6 Effect of surfactant on the hydroxyproline concentration of bating float

表2 坯革的物理性能Tab.2 Physical properties of crust leather

需要说明的是，不断增加表面活性剂的质量分数，并没有进一步改善皮革性能，反而降低了皮革性能。这一方面是因为表面活性剂在较低浓度下就能显著改变表/ 界面性质从而调控在界面上发生的物理化学过程，添加量无需过多；另一方面是不宜采用相同的软化时间进行比较，因为加入表面活性剂可以大幅提高酶在皮内的渗透速率、缩短皮革的酶处理时间（图3a）。

综上所述，合理使用表面活性剂有利于强化蛋白酶在皮内的传质，减少皮质损伤。

3 结论

阴离子型表面活性剂会不同程度地抑制胰蛋白酶活性，其中SDS 的抑制作用强，而非离子型表面活性剂对酶活性的影响小。论文选用的6 种表面活性剂均不同程度地增加了胰蛋白酶溶液的粒径，其中渗透剂T 甚至使酶溶液产生了沉淀现象。选用对酶活力和粒径影响较小的SDBS、AES、JFC-1 和AEO-9 辅助胰蛋白酶软化，这4 种表面活性剂均能通过显著降低酶溶液的表面张力，有效促进酶分子在裸皮内的渗透。另外，当酶溶液的表面张力接近时，不同表面活性剂强化酶传质的效果还与此时酶的分子尺寸有关，粒径越小的酶分子越容易渗透裸皮。综上所述，软化过程中宜选用对酶催化活性和分子尺寸均影响小的表面活性剂来降低酶溶液的表面张力，以便更好地强化传质，提高酶软化品质。