肺结核分枝杆菌感染与趋化因子MCP-1、MIF和炎症因子IL-6、IL-1α、IL-1β水平的关系分析

周 明,秦柯君,郭利敏

(新乡市中心医院 新乡医学院第四临床学院,河南 新乡 453000)

肺结核属于肺部慢性传染病。目前我国肺结核患病率仍居高不下,严重影响人类健康。而探索更为有效地预防、诊断结核病新技术和新方法是当前研究热点。结核分枝杆菌为肺结核感染菌,该菌入侵机体后先侵害宿主肺泡巨噬细胞,导致趋化及细胞因子受影响,发生炎性反应,降低机体免疫[1]。当机体发生炎症时,巨噬细胞通过分泌趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)和促炎性因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1α(interleukin-α,IL-1α)、白介素1β(interleukin-1beta, IL-1β)等炎性介质,直接或间接参与炎症反应综合征[2]。上述因子在机体炎症反应中起关键作用,能影响结核分枝感染的保护免疫反应。为此,本研究分析肺结核分枝杆菌感染与趋化因子、炎症因子的关系。旨在为临床提供有效地预防、诊断结核病新技术和新方法的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年1月在新乡市中心医院就诊的浸润性肺结核患者78例为结核组和60例正常健康人群为对照组,其中结核组男55例,女23例,年龄24～77岁,平均(38.65±14.85)岁,吸烟11例;对照组男41例,女19例,年龄23～76岁,平均(37.47±13.74)岁,吸烟10例;两组受试者性别、年龄一般资料比较无显著差异(P>0.05),有可比性。(1)纳入标准:①浸肺结核经结核菌素实验 、影像学、痰抗酸杆菌染色检查确诊; ②心、肝、肾功能基本正常; ③无合并糖尿病、矽肺、乙肝、肾病、艾滋病等疾病;④无吸毒、酗酒等不良嗜好;⑤全身状况良好。(2)排除标准:①妊娠者、酗酒者;②近期服用激素或免疫调节剂者。

1.2 方法

收集所有受试者血清,采用酶联免疫吸附测定法检测血液中趋化因子MCP-1、MIF和细胞因子IL-6、IL-1β、IL-1α。Elisa检测方法,首先严格按照试剂盒(购于武汉赛培生物科技有限公司)说明书备试剂、标准品;将不同浓度质控品、标准品、样本加入对应经处理后的微孔板内,100μL/孔。将反应空用封板胶纸封住,室温孵育2h;除去孔板中液体,清洗孔板,于每孔中加入300μL洗涤液,重复4次,洗板清洗完全后倒置板,直至孔板无任何残留液;加人200μL/孔酶标测抗体,反应孔用封板胶封住,室温孵育2h;重复洗板操作;加入200μL/孔显色底物,室温避光孵育30min;加入50μL/孔终止液后30min内在酶标仪上读取A540-A570值。绘制标准曲线,横坐标为标准品,纵坐标为A540-A570,根据样本A值,计算浓度。

采用 q-PCR法检测患者血清中MCP-1、 MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)水平。根据Trizol试剂盒(购于武汉科昊佳生物科技有限公司)说明提取血清总RNA,于血清中加入1mL Trizol,均匀混合后置入1.5mL EP管中,充分振荡后,室温放置5min完全裂解细胞。于EP管中加200μL氯仿,震荡15s。25℃条件下静置3min,12000rpm离心15min,得3层离心液,取上层清液400μL于1.5mL EP管内(经焦碳酸二乙酯处理后)。加 400μL异丙醇,混匀,室温放置2h后离心,弃上清,再加焦碳酸二乙酯处理后 75%乙醇,离心,弃上清,管内液风干,加20μL 焦碳酸二乙酯水,多次处理后完全溶解,得总RNA液。

配置1.5%琼脂糖凝胶,放入电泳槽内,加电泳缓冲液超过凝胶。混匀RNA样品和缓冲液加胶板样品槽内后,开展电泳,待溴酚蓝至胶板边沿约1cm处时,停止电泳。紫外灯下观察,凝胶系统成像后拍照保存。紫外分光光度计检测总RNA质量,取1μL RNA样品至紫外分光光度计测样台上测量开始,并记录 OD260/OD280值及浓度。将质量良好RNA 样品保存于-80℃冰箱中。采用10μL体系,室温下5min,基因组DNA去除反应;逆转录反应 cDNA的合成,用20μL体系,于恒温金属加热器中37℃ 15min反应结束,取1μL/标本cDNA用于PCR,-80℃保存备用。

PCR 反应,根据试剂盒操作,根据引物合成报告单各引物的理论Tm值,在梯度PCR仪上设退火温度梯度,范围54～60℃,循环参数30。产物电泳,反应结束后,取8μL PCR反应终产物经1.5%琼脂糖凝90V电泳40min后,于BIO-RAD成像仪上成像保存。 RT-qPCR检测血清的MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA的相对表达。每个样品设3个复孔,以2-CT法行数据分析。按照基因序列设计引物,见表1。

表1 基因PCR引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组受试者血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β水平比较

结核组MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β水平均高于对照组(P<0.05),见表2。

表2 两组受试者血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β水平比较

2.2 两组受试者血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA含量比较

结核组MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA含量均高于对照组(P<0.05),见图1。

图1 两组MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA表达

2.3 血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β与肺结核分枝杆菌感染的关系

血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β与肺结核分枝杆菌感染均呈正相关(P<0.05),见表3。

表3 MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β与肺结核分枝杆菌感染的关系

2.4 血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β诊断肺结核感染的敏感度与特异度

联合血清因子诊断敏感度、特异度高于单独MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β(P<0.05),见表4、图2。

图2 诊断肺结核感染的ROC曲线

表4 血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β诊断肺结核感染的敏感度与特异度

3 讨论

MIF为促炎细胞因子,参与机体局部或全身系统炎症反应。MIF可抑制体外巨噬细胞内结核分枝杆菌的繁殖,提示MIF参与结核病的发生发展[3]。但MIF面对复杂的机体免疫系统环境时,其对抗结核分枝杆菌的作用及水平表达程度的具体机制,需进一步确认。本研究结核患者血清MIF水平高于对照组,提示MIF水平参与肺结核分枝杆菌感染发病。MCP-1是趋化因子CC亚家族的典型代表,参与结核的发病机制。有研究发现,在结核宿主免疫中,MCP-1参与诱导结核感染,具有趋化作用[4,5]。有学者发现,肺结核分枝杆菌感染者机体内MCP-1水平明显高于健康正常者[6],与本文研究结果一致。有研究发现,肺结核分枝杆菌感染发病与细胞因子有关[7,8]。细胞因子如IL-6、IL-1α、IL-1β等在机体维持细胞免疫有重要意义。IL-6、IL-1α、IL-1β均为促炎性细胞因子。IL-6可诱导B细胞分化与形成抗体,还诱导T淋巴细胞增殖活化、分化,并参与机体免疫,促进炎症反应发生。有研究表明,肺结核分枝杆菌感染患者机体内存在促炎症因子,参与疾病发生[9]。本文肺结核分枝杆菌感染患者血清中IL-6水平高于对照组,证实IL-6参与该病症发病。IL-1α、IL-1β均属于IL-1家族,二者通过共同IL-1受体传递信号通路[10]。IL-1作为复杂多功能细胞因子,广泛参与细胞因子网络调节,调控机体各类细胞发挥作用。临床资料表明,IL-1α可诱导多类型细胞产生趋化作用,诱导单核浸润炎症局部,并在局部释放溶酶体酶,产生多炎症因子[11]。大量研究表明,IL-1β参与细胞凋亡相关炎症因子[12,13]。有研究发现肺结核感染患者机体内血清IL-1β水平均高于健康人群[14]。另有研究发现,较正常人群,肺结核感染患者机体血清IL-1α水平明显较高[15]。这与本研究结果一致,提示IL-1α、IL-1β参与肺结核分枝杆菌感染,这可能与肺结核分枝杆菌感染机体中巨噬/单核细胞分泌大量IL-1α、IL-1β,且成熟后的IL-1α、IL-1β能增强凋亡相关蛋白的活性有关。

分析患者外周血MCP-1、MIF和IL-6、IL-1α、IL-1β mRNA表达水平发现,趋化因子与炎症因子 mRNA表达水平趋势一致,肺结核分枝杆菌感染患者上述因子mRNA表达水平均显著高于对照组。血清MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β 水平表达与肺结核分枝杆菌感染均呈正相关。由此可见,肺结核分枝杆菌感染患者存在炎症反应,且MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β表达水平与患者疾病相关;提示MCP-1、MIF和IL-6、IL-1α、IL-1β 因子在肺结核分枝杆菌感染疾病中发挥重要作用。本研究显示,上述因子有一定诊断敏感度,且联合因子诊断敏感度均高于单独因子;再次表明MCP-1、MIF和IL-6、IL-1α、IL-1β 因子在肺结核分枝杆菌感染疾病中的重要性。

综上所述,MCP-1、MIF、IL-6、IL-1α、IL-1β参与肺结核分枝杆菌感染,且上述因子水平与该病呈正相关,联合因子诊断可提高敏感度。