结肠癌患者血清miR-370-3p、ANO1表达变化及其临床意义

张乐，李昊泽，刘凯东，白月奎

北京市海淀医院普外科，北京 100091

近年来，结肠癌发病率较直肠癌有增多趋势，尤其在41～65 岁人群中［1-2］。腹腔镜手术是治疗结肠癌的有效手段，但仍有部分患者术后复发，严重影响患者预后［3］。术后残留肿瘤细胞恶性进展是结肠癌复发的重要原因［4］。研究表明，微小RNA（miRNA）能调控多种靶基因参与结肠癌发生、发展［5］。miR-370-3p 是一种与肿瘤相关miRNA，其异常表达与结肠癌细胞增殖、分化、迁移和侵袭有关［6］。有研究证实，miR-370-3p 与急性髓系白血病复发有关［7］。茴香胺1（ANO1）是一种钙激活氯通道蛋白，能通过激活多条信号通路促进结肠癌恶性进展［8］，且与非小细胞肺癌复发有关［9］。本研究探讨血清miR-370-3p、ANO1 表达与结肠癌临床病理特征及术后复发的关系，以期为改善患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2019年12月本院收治的94 例结肠癌患者为结肠癌组，均接受腹腔镜手术治疗，男55例、女39例；年龄42～75（59.75 ±8.42）岁；肿瘤最大径≥5 cm 26 例、＜5 cm 68 例；肿瘤分化程度：低分化41 例、中高分化53 例；TNM 分期［10］：Ⅰ期25 例、Ⅱ期16 例、Ⅲ期42 例、Ⅳ期13 例；侵犯浆膜36 例、淋巴结转移39 例。纳入标准：经病理检查确诊为结肠癌，符合相关诊断标准［10］；初次确诊；具备腹腔镜术适应证（TNM分期Ⅰ～Ⅲ期根治性切除手术、Ⅳ期局部根治性手术）［11］。排除标准：入院前已接受抗肿瘤治疗患者；年龄＜18 岁患者；院内死亡患者；合并其他部位恶性肿瘤患者；腹腔镜术禁忌证（不能耐受二氧化碳气腹、妊娠期、严重心肝肾疾病不能耐受手术、术前不能纠正的全身状况不良、合并急性梗阻或穿孔）患者［12］；合并急慢性感染患者；合并血液系统损害患者；拒绝随访或失访患者。同期另选取50例结肠息肉患者为良性病变组，男29例、女21 例；年龄27～75（57.50 ± 9.39）岁。选取同期50名健康体检者为对照组，男28例、女22例；年龄18～72（56.80 ± 11.10）岁。对照组纳入标准：年龄≥18岁；各项生理指标检测正常。排除标准：有肿瘤病史者；近期使用血液制品者；既往心、肝、肾等重要脏器功能损害者。三组性别、年龄比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。各组患者或家属知情同意，且签署知情同意书；本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 血清miR-370-3p、ANO1 表达检测 采用实时荧光PCR法。收集结肠癌组术前和良性病变组、对照组体检时空腹静脉血3 mL，3 000 r/min 离心10 min（半径10 cm），留取血清，TRIzol试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司）提取血清总RNA，微量分光光度计（武汉艾维斯特科技有限公司）鉴定RNA浓度和纯度合格后，用逆转录试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）合成cDNA。逆转录条件：37 ℃ 1 h、80 ℃ 5 s。用实时荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行实时荧光定量聚合酶链反应。反应体系20 μL：cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、2×TransStart®Top Green qPCR SurperMix 10 μL、无核酸酶水8.5 μL；反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃30 s、72 ℃ 15 s 循环40 次。分别以U6 和GAPDH 为内参，2-ΔΔCT法计算血清miR-370-3p、ANO1 相对表达量。miR-370-3p上游引物序列5'-GCCTGCTGGGGTGGAACCTGGT-3'，下游引物序列5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；U6上游引物序列5'-CGCAAGGATGACACGCAAAT-3'，下游引物序列5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；ANO1上游引物序列5'-CAGGCGGTGCCTATGTCTCA-3'，下游引物序列5'-GCTCCTCCACTTGGTGGTTT-3'；GAPDH 上 游 引 物 序 列5'-GACCTGACCTGCCGTCTAG-3'，下游引物序列5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'。

1.3 术后复发统计及分组 结肠癌患者入院后均参考《腹腔镜结直肠癌根治术操作指南（2018版）》［11］接受腹腔镜手术治疗，术后通过门诊复查或电话进行定期随访，以手术时间为起点随访3年（第1 年3 个月/次，后2 年6 个月/次），随访至复发或2022年12月。术后复发定义为术后出现新的肿瘤，包括腹腔、盆腔、淋巴结等局部复发和肝、脑、骨、肺等远处复发，经病理检查或增强CT、磁共振成像、超声等影像学检查确诊。随访3 年，97 例结肠癌患者复发31例（复发组）、未复发63例（未复发组）。

1.4 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验；在线网站TargetScan（https：//www.targetscan.org/vert_80/）预 测miR-370-3p 与ANO1 的 靶 向 关系；Pearson 相关法分析结肠癌患者血清miR-370-3p与ANO1 mRNA 表达的相关性；用单因素与多因素Logistic回归分析结肠癌患者术后复发的影响因素；用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 对结肠癌患者术后复发的预测价值，曲线下面积比较用Delong 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表达比较 见表1。

表1 三组血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达比较（± s）

表1 三组血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与良性病变组比较，#P＜0.05。

组别结肠癌组良性病变组对照组P ANO1 mRNA 1.64 ± 0.33*#1.14 ± 0.23 1.14 ± 0.21＜0.05 n 94 50 50 miR-370-3p 0.74 ± 0.17*#1.23 ± 0.23 1.27 ± 0.16＜0.05

2.2 结肠癌患者血清miR-370-3p与ANO1 mRNA表达的关系 在线网站TargetScan 预测miR-370-3p 与ANO1在649～655和676～682处有结合位点。Pearson相关分析结果显示，结肠癌患者血清miR-370-3p 与ANO1 mRNA中表达呈负相关（r=-0.609，P＜0.05）。

2.3 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表达与结肠癌患者临床病理特征的关系 见表2。

表2 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达与结肠癌患者病理特征的关系（± s）

表2 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达与结肠癌患者病理特征的关系（± s）

临床病理特征性别n miR-370-3pimages/BZ_7_1783_1060_1800_1116.png± s P ANO1 mRNAimages/BZ_7_1783_1060_1800_1116.png± s P＞0.05＞0.05男女年龄55 39 0.74 ± 0.17 0.73 ± 0.18 1.66 ± 0.33 1.62 ± 0.34＞0.05＞0.05≥60岁＜60岁肿瘤最大径45 49 0.72 ± 0.16 0.75 ± 0.19 1.66 ± 0.28 1.63 ± 0.38＞0.05＞0.05≥5 cm＜5 cm分化程度26 68 0.70 ± 0.15 0.75 ± 0.18 1.3 ± 0.32 1.61 ± 0.33＜0.05＜0.05低分化中高分化TNM分期41 53 0.68 ± 0.15 0.78 ± 0.18 1.73 ± 0.31 1.58 ± 0.34＜0.05Ⅰ～Ⅱ期＜0.05Ⅲ～Ⅳ期侵犯浆膜41 55 0.78 ± 0.17 0.70 ± 0.17 1.54 ± 0.31 1.72 ± 0.34＜0.05＜0.05有无淋巴结转移36 58 0.67 ± 0.15 0.78 ± 0.18 1.76 ± 0.31 1.57 ± 0.33＜0.01＜0.01有无39 55 0.66 ± 0.14 0.79 ± 0.18 1.78 ± 0.31 1.54 ± 0.31

2.4 结肠癌患者术后复发的影响因素

2.4.1 单因素分析结果 肿瘤分化程度、TNM 分期、侵犯浆膜、淋巴结转移、miR-370-3p、ANO1 mRNA 均为结肠癌患者术后复发的影响因素（P均＜0.05）。见表3。

表3 结肠癌患者术后复发影响因素的单因素分析

2.4.2 多因素分析结果 以单因素分析差异有统计学意义因素为自变量，术后复发（是/否=1/0）为因变量，多因素Logistic回归分析显示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、侵犯浆膜、淋巴结转移和ANO1 mRNA≥1.64为术后复发的独立危险因素，miR-370-3p≥0.74 为独立保护因素（P均＜0.05）。见表4。

表4 结肠癌患者术后复发影响因素的多因素Logistic回归分析

2.5 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 对结肠癌患者术后复发的预测价值 ROC 曲线分析显示，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 联合预测结肠癌患者术后复发的曲线下面积（0.876）大于二者单独预测的曲线下面积（0.786、0.783），比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表5。

表5 血清miR-370-3p、ANO1 mRNA对结肠癌患者术后复发的预测价值

3 讨论

miRNA 是一类新兴表观遗传调控分子，能通过引发信使RNA（mRNA）的降解或转录后基因沉默，进而参与结肠癌发生、发展过程［5］。miR-370-3p 是人染色体14q32.31上的一个miRNA，王晓欣等［12］研究报道，下调miR-370-3p 能靶向叉头盒蛋白M1 抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。JIA 等［13］研究报道，上调miR-370-3p 表达能靶向Y 染色体性别决定区盒转录因子4抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解。上述研究表明，miR-370-3p 在不同肿瘤中均发挥作用。LIU 等［6］利用大数据挖掘技术发现，miR-370-3p异常表达与结肠癌细胞进展有关。同时有研究报道，miR-370-3p 异常表达与急性髓系白血病和乳腺癌复发有关［7，14］。因此推测miR-370-3p 可能与结肠癌术后复发有关。本研究结果显示，结肠癌患者血清miR-370-3p 表达降低，与分化程度、TNM分期、侵犯浆膜和淋巴结转移有关，miR-370-3p≥0.74 是术后复发的独立保护因素，说明血清miR-370-3p低表达参与结肠癌发生、发展，miR-370-3p高表达可降低术后复发风险，分析原因可能是miR-370-3p 高表达能下调三结构域蛋白14，通过抑制新生血管形成为术后残留肿瘤病灶提供生长所需养分，抑制残留肿瘤病灶持续增殖和分化，进而降低结肠癌术后复发风险［15］。

碘离子转运体的非碘转运功能对肿瘤发生、发展至关重要，其异常表达可调节核因子-κB、丝裂原活化蛋白激酶、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-连环蛋白等信号通路，进而调控肿瘤增殖、分化、迁移、浸润、复发、耐药等过程［8］。ANO1 是一种分布于甲状腺、肠胃、肝脏、肾脏、肺脏等多种组织中的碘离子转运体，又称跨膜蛋白16A，其非碘转运功能参与多种肿瘤进程［16］。如ANO1 能激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进胆管癌细胞存活和增殖［17］；能激活转化生长因子-β、核因子-κB、Janus 激酶/信号转导和转录激活因子3 信号通路，促进头颈部鳞状细胞癌上皮-间充质转化［18］。张喆等［19］基于癌症基因组图谱数据库分析发现，ANO1 高表达与结肠癌患者预后不良有关。同时有研究报道，ANO1 高表达与非小细胞肺癌、乳腺癌复发有关［9，20］。本研究结果显示，ANO1 表达在结肠癌患者血清中升高，与分化程度、TNM 分期、侵犯浆膜和淋巴结转移有关，miR-370-3p≥1.64 是术后复发的独立保护因素，说明血清ANO1高表达参与结肠癌发生、发展，并会增加术后复发风险。分析原因可能是ANO1 高表达能激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，调节下游转录因子激活，促进术后残留肿瘤细胞增殖、分化、迁移和侵袭，导致结肠癌术后复发风险增加［21］。

本研究显示，结肠癌患者术后复发因素还包括TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、侵犯浆膜、淋巴结转移，分析原因是分期越晚、伴有侵犯浆膜和淋巴结转移反映肿瘤恶性程度更高，手术难以切除，可能残留更多肿瘤病灶，增加复发风险［2］。通过网站预测发现，miR-370-3p与ANO1存在结合位点，相关性分析也发现结肠癌患者血清miR-370-3p 与ANO1 表达呈负相关，提示miR-370-3p与ANO1可能共同参与结肠癌术后复发。孙欣华等［22］研究也证实，上调miR-370-3p 表达能靶向ANO1抑制结肠癌细胞增殖和迁移。本研究ROC曲线分析显示，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表达分别为0.75、1.68 时，预测结肠癌患者术后复发的曲线下面积分别为0.786、0.783；血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 联合预测结肠癌患者术后复发的曲线下面积为0.876，大于miR-370-3p、ANO1 mRNA 单独预测。说明两者有助于结肠癌患者术后复发预测，且联合检测能提升预测价值。

综上所述，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA 表达与结肠癌患者肿瘤分化程度、TNM 分期、侵犯浆膜、淋巴结转移和术后复发有关，血清miR-370-3p 联合ANO1 mRNA 对结肠癌患者术后复发具有较高预测价值。但本研究结果还需多中心、大样本研究证实。