白细胞介素4参与调控骨改建的研究进展

唐榕

1 山东大学齐鲁医学院口腔医学院·口腔医院骨代谢研究室 山东省口腔组织再生重点实验室，济南 250012；2 山东大学骨质疏松与骨矿盐疾病研究中心；3 山东大学口腔医学院口腔基础医学教研所

骨改建是指旧骨不断吸收，新骨不断形成的过程，是骨骼系统经历的有序且耦合的动态连续过程。骨改建可分为3 个阶段，即破骨细胞介导骨吸收、骨髓间充质干细胞（BMSC）来源的成骨细胞被募集到骨吸收的部位、成骨细胞介导骨形成［1］。成骨细胞和破骨细胞共同参与骨改建过程，它们构成的动态平衡决定体内骨骼系统的稳定。同时，骨改建的过程受多种病理因素的影响，包括雌激素缺乏、衰老、疾病、药物和免疫系统紊乱。免疫细胞分泌的各种可溶性介质会影响成骨细胞和破骨细胞的活性，包括细胞因子、趋化因子和生长因子［1］。其中白细胞介素（IL）是免疫细胞产生的细胞因子，能够激活和调节免疫细胞，在炎症反应中发挥重要作用。IL-4作为一种经典的适应性免疫调节细胞因子，不仅参与免疫功能的调节，还在皮炎、过敏、哮喘、肿瘤等疾病中发挥作用。目前，免疫微环境对骨改建中的调控作用已有较多研究报道，这逐渐成为学术界的共识，然而IL-4 参与骨改建的相关研究较少，缺乏系统和全面的概括整理［2-3］。本文对IL-4 调控骨改建的相关研究进行综述，为IL-4的应用提供新思路。

1 IL-4参与调控骨改建的作用机制

1.1 直接影响骨改建

1.1.1 对破骨细胞的影响 IL-4 对成熟破骨细胞的生成具有抑制作用，这是目前的主流认识。有研究通过体外培养人源和鼠源的破骨细胞，发现IL-4通过STAT6 依懒性方式抑制破骨前体细胞核因子κB（NF-κB）受体激活蛋白（RANK）基因的表达，抑制破骨细胞的生成［4］。另有研究表明，IL-4以STAT6依赖的方式可逆地阻止破骨细胞生成，通过阻止NF-κB 抑制蛋白的磷酸化，阻止NF-κB 活化以及阻断c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38 蛋白激酶（p38）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）3 个丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），对破骨细胞生成发挥抑制作用［5］。此外，IL-4通过作用于破骨细胞前体，使其优先向巨噬细胞分化，从而减少破骨细胞的形成；其他研究也报道了类似的结果，在IL-4刺激后，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞在基因和蛋白表达水平以及吞噬作用方面都表现出更多的巨噬细胞特性，相比破骨细胞更倾向于分化为巨噬细胞［6］。体内研究也验证了这一现象，向植入物添加IL-4涂层，免疫组织化学染色分析和显微计算机断层扫描结果均显示大鼠骨愈合增强，IL-4 的添加抑制了破骨细胞的分化和骨吸收［7］；另有研究证实，IL-4 能够通过抑制NF-κB 受体活化因子配体（RANKL）的表达抑制破骨细胞的形成，并在体内直接抑制破骨细胞前体的激活。

综上所述，IL-4调控破骨细胞的具体机制包括，IL-4在细胞膜上与IL-4Rα结合后，激活STAT6，一方面，STAT6激活后形成二聚体进入细胞核，参与调控基因表达，抑制了细胞核内RANK 的转录，使得与RANKL 结合的RANK 减少，抑制成熟破骨细胞的形成，同时RANK信号传导中的远端事件还包括NF-κB复合物、JNK、p38 和ERK 的激活；另一方面，STAT6通过直接抑制NF-κB和MAPK，抑制破骨细胞生成。

1.1.2 对成骨细胞的影响 当前关于IL-4 对成骨细胞的作用，各研究结果尚不统一。早期大量学者认为，IL-4对成骨细胞有抑制作用，近几年一些证据表明IL-4 可以促进成骨，但是尚不足以推翻之前的认识。有研究表明，向小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）中添加IL-4和IL-13都能够抑制其向成骨细胞分化［8］，还有证据表明IL-4 通过下调甲状旁腺激素（PTH）诱导的MC3T3-E1 的碱性磷酸酶活性来抑制成骨细胞的生成。然而，在正畸牙齿移动大鼠模型中，IL-4 在促进成骨细胞分化的同时抑制破骨细胞活性，从而提高正畸治疗的成功率，降低复发率［9］。此外，间充质干细胞（MSCs）作为成骨细胞的来源，IL-4可以通过影响BMSCs实现对成骨的调节。有研究表明，通过向小鼠移植能够分泌IL-4 的MSCs，增加了小鼠股骨的骨矿物质密度［10］；还有文献证明，通过在骨生物活性水凝胶珠中负载IL-4，有效促进了骨缺损再生，IL-4 促进巨噬细胞M2 极化，增加转化生长因子β1（TGF-β1）表达水平，进而激活BMSCs 中的TGF-α1/Smad 蛋白信号通路，并促进成骨分化［11］。然而，现有证据尚不足以明确IL-4 对成骨细胞的具体影响，仍需进一步研究。

1.2 间接影响骨改建

1.2.1 通过调控T细胞影响骨改建 IL-4与T细胞的关系密切，相关研究和报道较多。T 细胞按功能可以分为CD4+T 细胞即Th 细胞、CD8+T 细胞即细胞毒性T 细胞和调节性T 细胞（Treg）。其中CD4+T 细胞可受不同细胞因子的调控向不同谱系分化，包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22 和滤泡辅助性T 细胞，未受抗原刺激的初始CD4+T 细胞为Th0。IL-4 能够诱导Th0 向Th2 分化，其中IL-4 主要由局部内环境中的自然杀伤T 细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等产生。在此过程中，IL-4 与细胞膜上的IL-4R 结合，激活STAT6 以及下游的GATA 结合蛋白3，从而促进Th0 细胞向Th2 细胞分化［12］。Th2 细胞能够分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及IL-13 等，这些细胞因子能够促进Th2 细胞增殖，进而辅助B 细胞活化，同时抑制Th1 细胞增殖。现有证据表明Th2 细胞可能起到骨保护作用。活性Th2细胞通过增强PTH 的产生来维持成骨细胞活性［13］。此外，IL-4 激活的STAT6与转录因子叉头蛋白P3启动子的非编码片段结合，能够抑制Th0细胞向Treg 细胞分化［12］。当TGF-β 和IL-4共同存在时能够诱导Th0向Th9分化，TGF-β 单独诱导Th2细胞也能产生Th9细胞，其主要分泌IL-9和IL-10，对破骨细胞具有抑制作用。

当Th 细胞受到除IL-4 外其他细胞因子刺激时，可分化为其他亚群。其中Th1细胞通过产生γ-干扰素（IFN-γ），增加泛素连接酶TNF 受体关联因子6（TRAF6）的降解，抑制破骨细胞的形成；但IFN-γ 还能在破骨细胞形成的晚期促进破骨细胞成熟。Th1细胞也能产生肿瘤坏死因子α（TNF-α），通过增加RANKL 的表达来增加成骨细胞凋亡，并促进破骨细胞生成。另外，Th17 细胞通过分泌各种促炎因子，包括IL-1、IL-17、IL-22 和TNF-α，从而促进破骨细胞生成。其中，IL-17 能够上调破骨细胞前体上的RANK 受体以促进破骨细胞分化；同时，IL-17 还可以抑制骨形态发生蛋白2（BMP-2）诱导的成骨细胞分化［14］，并在体外通过NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3 炎性小体途径诱导成骨细胞的细胞焦亡。然而，最近有研究显示，IL-17 可以促进小鼠的成骨细胞分化、骨再生和改建［15］。此外，IL-4 还能抑制Treg 细胞分化，Treg 细胞能够产生抗炎细胞因子IL-10和TGF-β。Treg细胞可通过表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4以去除在破骨细胞前体表达的共刺激分子B 淋巴细胞活化抗原80/B 淋巴细胞活化抗原86，从而实现对破骨细胞成熟的抑制。然而，最近的一项研究指出，Treg 细胞通过减少破骨细胞数量而非抑制破骨细胞分化来发挥骨保护作用［16］。

1.2.2 通过调控B 细胞影响骨改建 IL-4 能够激活B 细胞，增强B 细胞呈递抗原的能力，刺激B 细胞增殖和分化成浆细胞。然而，IL-4 调控B 细胞的具体作用机制目前尚未明确。有研究向体外培养的B细胞中加入IL-4，通过细胞凋亡和免疫印迹实验发现B 细胞中IRS2 的酪氨酸磷酸化，与PI3K 结合，该通路以不依赖STAT6 的方式减少B 细胞的凋亡；通过进一步的实验，作者认为IL-4 能够通过MAPK 通路促进B 细胞的增殖［17］。此外，最近研究表明，IL-4能够以STAT6 依赖性的方式，调控记忆B 细胞分化相关转录因子Hhex、Bach2和Zbtb32的表达，从而抑制记忆B 细胞的分化［18］。一篇关于类风湿关节炎（RA）的动物研究报道，B 细胞和浆细胞均可通过递送RANKL 来调节破骨细胞生成［19］。然而，B 细胞也是骨保护素（OPG）的主要来源，OPG 对破骨细胞的生成具有抑制作用。尽管目前对B细胞的关注主要集中在破骨细胞生成上，但最近的一项研究在RA小鼠模型中发现，B 细胞通过激活ERK 和NF-κB 信号通路来抑制成骨细胞分化［20］，从而抑制骨形成。特别是，B 细胞的作用受T 细胞亚群的影响。当被Th1相关细胞因子激活时，B细胞可以抑制破骨细胞生成；但在Th2 细胞因子的刺激下，B 细胞促进破骨细胞生成。综上，IL-4 通过激活B 细胞抑制成骨细胞，同时对破骨细胞具有双重作用；IL-4还能通过调节Th 细胞的分化，从而影响B 细胞的功能，实现对破骨细胞的保护作用。

1.2.3 通过调控巨噬细胞影响骨改建 巨噬细胞根据活化状态和功能的不同，可分为经典活化的巨噬细胞（M1 型）和M2 型巨噬细胞。促炎表型M1 极化的巨噬细胞能够产生TNF-α、IL-1β 和IL-6，从而促进破骨细胞的形成。当巨噬细胞受到IL-4的刺激时，会极化成抗炎表型M2 巨噬细胞。精氨酸代谢的不同是M1 型巨噬细胞和M2 型巨噬细胞的区别之一，M2 型巨噬细胞高表达精氨酸酶1（Arg1）。在M2型巨噬细胞中，IL-4信号通路激活STAT6，STAT6能够直接与Arg1 基因的启动子结合，从而引起Arg1高表达［21］。此外，PI3K/Akt/mTOR 信号轴是参与巨噬细胞极化的主要通路，M1/M2 极化依赖于特定的Akt、PI3K 和mTOR 亚型。M1 型巨噬细胞极化依赖于Akt2 和mTORC1，而当IL-4 与IL-4R 结合后，通过IRS2激活PI3K，通过Akt1和mTORC2的激活最终诱导巨噬细胞向M2型极化。M2型巨噬细胞具有骨保护作用，通过刺激MSCs和前成骨细胞分化为成熟成骨细胞来促进骨矿化。同时，M2型巨噬细胞具有较高的血管生成潜能，间接促进成骨；M2型巨噬细胞可分泌细胞因子，如IL-10、BMP-2和TGF-β1等，其中大部分参与抑制破骨细胞骨吸收；M2型巨噬细胞亚群还能参与凋亡细胞清除，维持骨转换稳态。因此，IL-4通过调节巨噬细胞极化间接发挥骨保护作用。

2 IL-4参与骨相关疾病的发生、发展

2.1 关节炎 IL-4与关节炎的相关研究较为丰富，是当前关节炎发病和治疗的热点研究方向之一。关节炎是一种进行性自身免疫性疾病，以滑膜关节炎症以及全身表现为特征。其中，RA是关节炎较为广泛的一大亚型。RA的特征之一是滑膜炎，这是由免疫细胞持续在关节组织募集引起的。IL-4 在RA 的滑膜中具有直接的抗炎作用，其减少巨噬细胞炎症因子IL-1β 和TNF 的产生，以及人免疫球蛋白G Fc段受体Ⅰ和人免疫球蛋白G Fc 段受体Ⅲ的表达。IL-4-590 基因位点启动子的多态性，被认为是RA 严重的遗传危险因素［22］。另一种常见的关节炎是骨关节炎（OA），会导致关节部位出现疼痛、肿胀或僵硬。手部、膝盖和髋关节OA 的发生被认为与IL-4 和IL-4Rα基因编码的多态性有关。与健康人相比，OA患者血清中的可溶性IL-4Rα 水平升高，滑膜细胞和滑膜液中的IL-4浓度也更高。IL-4具有软骨保护作用，其能够通过抑制金属蛋白酶的分泌，减少OA 发病过程中常见的蛋白多糖的产生，对关节软骨中蛋白多糖的降解具有抑制作用。而在OA 患者体内中，软骨细胞对IL-4作用的易感性降低，这可能是造成关节软骨快速退化的原因之一［23］。在多种关节炎动物模型实验中，IL-4 相关治疗均显著延缓了关节炎的进展。在胶原诱导的关节炎模型中，连续给予IL-4 延迟了关节炎的发作，关节损伤和炎症较轻。在蛋白多糖诱导的关节炎模型中，IL-4 敲除小鼠表现出加重的关节炎趋势，关节炎的恶化被认为与STAT6信号途径有关。在甲基化牛血清白蛋白/IL-1诱导的关节炎小鼠中，用中和IL-4 抗体处理后显示关节炎症减轻30%，表明IL-4 能够影响CD4+T 细胞依赖性关节炎［24］。与野生型小鼠相比，IL-4Rα 基因敲除小鼠和LysMcreIL-4Rαflox/-小鼠的关节炎症严重程度增加［25］。IL-4通过抑制滑膜成纤维细胞中血管内皮生长因子的表达抑制血管生成［26］。巴西钩虫Nippostrongylus brasiliensis 造成的蠕虫感染，导致肿瘤坏死因子转基因关节炎小鼠体内存在大量的Th2细胞和嗜酸性粒细胞，而IL-4/IL-13 诱导的STAT6信号通路参与减轻关节炎症［27］。大量证据表明IL-4在关节炎发病中的作用，动物模型以及体外通路验证的结果均表明，IL-4 的抗炎特性有益于关节炎的治疗，IL-4 可能是治疗关节炎的新型有效方法。因此，进一步的研究对于揭示和理解IL-4 在关节炎中确切的作用机制至关重要。

2.2 骨质疏松症 骨质疏松症作为一种全身代谢性疾病，主要以患者骨量降低、骨微结构损伤以及骨脆性增加为临床表现，严重的骨质疏松症可能导致骨折和死亡。骨质流失与破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成的不平衡有关。骨质疏松症的发病原因是多方面的，增龄和衰老造成的器官功能减退是主要因素，上述提到的T 细胞、B 细胞和巨噬细胞也参与骨质疏松症的发病。目前关于IL-4直接影响骨质疏松症的相关文献较少，但是有研究证明过度表达IL-4的小鼠出现类似人类骨质疏松症的全身性骨丢失，在小鼠体内观察到骨改建活动减弱，成骨细胞和破骨细胞募集受到抑制［28］。如前所述，IL-4 可以通过影响破骨细胞和成骨细胞的平衡调节骨改建［4-11］，从而实现对骨质疏松症的影响，因此IL-4 可能作为骨质疏松症治疗的新靶点。

2.3 牙周炎 牙周炎是一种免疫性炎症性疾病，伴随着牙周骨组织和结缔组织的进行性破坏。在牙周炎患者中检测到相关细胞因子的改变，其中促炎和抗炎细胞因子的相互作用与疾病发展密切相关［29］。由于IL-4的抗炎作用以及对破骨细胞的抑制，IL-4在牙周炎疾病发展中可能起到保护作用，已有研究证明了这一猜想［30］。此外，IL-4 通过促进巨噬细胞M2极化，改善糖尿病牙周炎患者的牙槽骨吸收［22］。因此，在牙周炎的治疗中，IL-4的作用值得进一步研究。

2.4 骨移植不良反应 IL-4 在缓解骨移植不良反应造成的骨溶解方面的相关研究较多，是当前的研究热点之一。骨移植是修复大面积骨缺损的有效策略，然而，对生物支架和种植体的宿主免疫反应经常导致临床植入失败，被认为是影响再生功效的关键因素。针对植入物产生的磨损颗粒引起慢性巨噬细胞介导的炎症反应，调控巨噬细胞极化和预防趋化因子配体2 诱导的巨噬细胞趋化是减少骨溶解和无菌全关节置换松动的新兴策略［31］。通过种植体递送IL-4 或在水凝胶上负载IL-4 的方式，可实现骨小梁体积的增加以及骨溶解的降低［32］，表明IL-4 可诱导巨噬细胞M2 极化，促进BMSCs 的成骨分化［33］，增加骨缺损愈合能力［34］，证明IL-4 是减轻磨损颗粒诱导植入物周围骨溶解的潜在治疗策略。此外，载有IL-4 的植入物在皮下植入后，通过直接刺激内皮细胞和间接调控免疫微环境，诱导新血管形成，表现出优异的促血管生成能力［35］，促进周围组织的愈合。因此，负载IL-4 是临床种植体修复骨缺损的热点方向和未来希望，值得专家学者的深入研究。

IL-4 作为一种适应性免疫调节细胞因子，不但直接参与机体的免疫调节，还直接或间接影响骨改建的平衡。众多研究表明，IL-4 在骨相关疾病中具有重要作用。然而，目前针对IL-4 治疗骨相关疾病的研究仍停留在基础研究层面，临床研究尚未充分展开。因此，推动基础研究转化为临床应用是当前工作的重点，未来的研究工作方向应该是探索IL-4在改善骨改建相关疾病方面的可行性以及相关治疗方法的开发。