产妇康煎剂对孕期大鼠胎盘的影响 *

李瑞丽 柏 贞 王雪嫄 王晶烁 林佳微 傅金英

（河南中医药大学第二临床医学院，河南 郑州 450046）

胎盘植入是产科的严重并发症之一，指胎盘绒毛侵入子宫肌层，导致产后胎盘无法从宫腔剥离；根据胎盘绒毛侵入子宫肌层深度，可分为胎盘粘连、胎盘植入、穿透性胎盘植入［1］。胎盘植入是导致严重产后出血、子宫切除、产褥期感染的主要原因，严重威胁孕产妇的生命安全和生活质量［2］。近年来，随着剖宫产率的增长，高龄产妇人数的增多及人工流产、引产病例的增多，胎盘植入有逐年增多的趋势，发病率增加了10倍［3，4］。研究［5］表明，胎盘植入的发生率为1%～23%，而穿透性胎盘植入的发生率为0.3%。中国是世界剖宫产率较高的国家之一，高达40%～50%，由此可以推断，中国胎盘植入的发病人数应远远高于世界平均水平。随着生活水平的提高、国家“三胎”政策的放开以及人们观念的转变，保留生育功能、成功保守治疗胎盘植入，已成为临床亟待解决的问题之一。

我们在前期研究［6-10］中发现，自拟“产妇康煎剂”对治疗胎盘植入效果显著。本研究拟通过建立妊娠大鼠模型，观察孕鼠用药后胚胎生长数量、外周血人绒毛膜促性腺激素（HCG）水平、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平、胎盘滋养细胞Bcl-2 和Bax 的表达水平等指标，探讨产妇康煎剂对妊娠大鼠胎盘作用的影响及其作用机制，初步阐明产妇康煎剂治疗胎盘植入的机制，为临床提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级健康成年雌性SD大鼠36只，雄性SD 大鼠18 只，体质量（200±30）g，购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，合格证号：SCXK（豫）2019-0002，在通风，湿度、温度适宜的河南省中医院中心实验室动物室内喂养。

1.1.2 药品制备产妇康煎剂组方（成人每天用量）：黄芪30 g，益母草30 g，莪术20 g，天花粉50 g，姜黄20 g，紫草30 g，当归12 g，蜈蚣2条（10 g），赤芍12 g，炮姜12 g，甘草6 g，茯苓15 g。所用生药饮片由河南省中医院制剂室提供，按照院内制剂标准浓煎、过滤，所煎药液浓缩至每毫升含生药2.47 g，4 ℃冰箱保存备用。

1.1.3 主要试剂RIPA 裂解液（Servicebio 公司，货号：G2002），PMSF（100 mmol）（Servicebio 公司，货号：G2008），磷酸化蛋白酶抑制剂（Servicebio 公司，货号：G2007），BCA蛋白定量检测试剂盒（Servicebio公司，货号：G2026），蛋白Marker（Servicebio 公司，货号：26617），PVDF 膜（0.45 μm）（Servicebio 公司，货号：G6015-0.45），吐温20（Tween 20）（Servicebio 公司，货号：WGT8220），普通ECL 化学发光试剂盒（Servicebio公司，货号：G2014），β-actin 内参鼠抗体（Servicebio公司，货号：GB12001），HRP 标记山羊抗小鼠IgG 抗体（Servicebio 公司，货号：GB23301），HRP 标记山羊抗大鼠（Servicebio 公司，货号：GB23302），普通转膜缓冲液（Servicebio 公司，货号：G2017），Tris-甘氨酸 SDSPAGE 普通电泳缓冲液（Servicebio 公司， 货号：G2018），TBS 缓冲液（Servicebio 公司，货号：G0001-2L），TRizol RNA 提取液（Servicebio 公司，货号：G3013-100ML），逆转录酶（Servicebio 公司，货号：G3337-50Rxns），荧光染料SYBR Green（Servicebio 公司，货号：G3326-15ML），GADPH 引物（Servicebio 公司，货号：GYW00012）。

1.1.4 主要仪器酶标仪（Rayto 公司，型号：RT-6100），研磨仪（Servicebio 公司，型号：KZ-II），台式高速冷冻离心机（DRAGONLAB 公司，型号：D3024R），掌上离心机（Servicebio 公司，型号：D1008E），涡旋混合器（Servicebio 公司，型号：MX-F），磁力搅拌器（Servicebio 公司，型号：MS-PB），脱色摇床（Servicebio公司，型号：TSY-B），垂直电泳仪（Servicebio 公司，型号：BV-2），转印电泳仪（Servicebio 公司，型号：BT-2），超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物公司，型号：JY92-11N），灰度分析软件（Alpha Innotech 公司，型号：alphaEaseFC），图像分析软件（Adobe 公司，型号：Adobe PhotoShop），荧光定量PCR 仪（Bio-rad 公司，型号：CFX Connect）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立选用8 周鼠龄、SPF 级雌性SD大鼠36 只，未产；雄性SD 大鼠18 只；清洁级饲养，喂以标准大鼠饲料。适应性喂养1 周后，将雌雄大鼠按2∶1 合笼（每笼3 只）：头天傍晚5 点将雌鼠放入雄鼠笼中，次日晨8 点前取出；雌鼠进行阴道分泌物涂片检查，将分泌物涂于干净载玻片上，放置显微镜下，见雄鼠精子满视野，视为妊娠第1 日，取出单独饲养；未孕者仍与雄鼠合笼，直至受孕。

1.2.2 动物模型的分组与干预方法将36只受孕雌鼠随机分为中药组、生理盐水组、空白对照组，每组12 只。各组大鼠给药方法如下：中药组：妊娠第6 天开始至妊娠第19 天，连续14 d，每日上午8∶00 给予产妇康煎剂浓缩液灌胃10 mL/kg，所含生药量为2.6 g/mL，相当于成人等效剂量的6 倍。生理盐水组：妊娠第6 天开始至妊娠第19 天，连续14 d，每日上午8∶00 给予生理盐水灌胃10 mL/kg。空白对照组不处理。中药组和生理盐水组在妊娠第0、6、10、14、18天称体质量，并按体质量调整给药量。

1.2.3 实验指标和检测方法

1.2.3.1 胎盘生长数量妊娠第19 天麻醉处死孕鼠后，统计3组孕鼠胎盘数量。

1.2.3.2 ELISA 法测定外周血HCG 及ALT 与AST 检测（1）取全血标本用离心机离心20 min获取血清，按HCG 试剂盒要求立即检测。以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线；用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

（2）取全血标本4 ℃过夜后，用离心机在8 ℃下，离心15 min 取上清，按ALT 与AST 试剂盒要求立即检测，余步骤同上。

1.2.3.3 Realtime PCR 法检测胎盘滋养细胞Bcl-2 和Bax 的mRNA 表达取各组孕鼠胚胎组织，剪碎、研磨、离心后，TRizol 提取总RNA，溶于无RNA 酶的灭菌超纯水中，用Nanodrop 2000 型超微量分光光度计（Thermo 公司）测定总RNA 的浓度和纯度，同时采用琼脂糖电泳观察其完整性。将RNA 稀释成1 mg/L，-80 ℃保存。逆转录酶作用下完成逆转录（Promega），将荧光染料SYBR Green 和目的基因Bcl-2（Servicebio 公司）和Bax（Servicebio 公司）引物与内参基因GADPH 的引物（引物序列见表1）混匀后，加入检测板、密封、上机（荧光定量PCR 仪）检测。采用反应条件：94 ℃预变性；94 ℃ 50 s、55 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s、72 ℃ 10 min，共30 个循环。每个循环在60℃延伸时收集荧光值，测定达到荧光阈值时的最小循环次数（Ct 值），根据PCR反应信号强度Ct 值计算每个样本目的基因mRNA 的相对表达量。完成后进行溶解曲线测定，溶解曲线程序设置为：95 ℃ 10 s，65～95 ℃，每0.5 ℃进行1 次溶解曲线分析。

表1 检测基因引物序列

以GADPH 为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，其中ΔΔCt=（Ct 目的基因-Ct GADPH）处理组-（Ct 目的基因-Ct GADPH）对照组。记录数据并分析实验结果。

1.2.3.4 Western blot 法检测胎盘滋养细胞Bcl-2 和Bax蛋白表达取各组孕鼠胎盘与子宫剥离面滋养细胞相对丰富部位胎盘组织，经蛋白提取、浓度测定、蛋白变性、电泳分离及转膜后进行免疫印迹，经封闭、加抗体、洗膜，用增强化学发光剂进行发光后再行曝光显影，将显影条带放Adobe PhotoShop 图像分析处理系统，利用Adobe PhotoShop 软件，电脑直接扫描测定显影条带积分光密度值，条带的积分光密度值即表示蛋白的表达量，计算每份样本中Bax 与Bcl-2 蛋白的相对表达水平（目的蛋白/β-actin）。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0 软件进行统计分析。计量资料以（±s）表示，符合正态分布的，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；不符合正态分布的，转化为正态分布，再进行统计处理。计数资料以率（%）表示，组间比较采用x2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组孕鼠胎盘生长数量比较3组孕鼠胎盘生长数量比较，F值为3.89，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 3组孕鼠胎盘生长数量的比较（±s）

表2 3组孕鼠胎盘生长数量的比较（±s）

注：与生理盐水组比较，1）P＜0.05；与中药组比较，2）P＜0.05。

胎盘数量/个10.42±0.511）12.08±2.27 12.00±1.652）组别中药组生理盐水组空白对照组鼠数12 12 12

2.2 3 组孕鼠胎盘滋养细胞Bcl-2 和Bax 的mRNA 相对表达量比较3 组孕鼠Bcl-2 mRNA 相对表达量比较，F值为7.20，差异有统计学意义（P＜0.05）。3 组之间Bax mRNA 相对表达量比较，F值为4.39，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 3组孕鼠胎盘滋养细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA相对表达量比较（±s）

表3 3组孕鼠胎盘滋养细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA相对表达量比较（±s）

注：与生理盐水组比较，1）P＜0.05；与中药组比较，2）P＜0.05。

组别中药组生理盐水组空白对照组Bax mRNA 1.10±0.281）0.94±0.30 0.89±0.162）鼠数12 12 12 Bcl-2 mRNA 1.34±0.231）1.68±0.06 1.76±0.432）

2.3 3组孕鼠胎盘滋养细胞Bcl-2 和Bax 蛋白相对表达水平比较 3 组孕鼠Bcl-2 蛋白表达的影响，F值为39.21，差异有统计学意义（P＜0.05）。3 组孕鼠Bax 蛋白表达的影响，F值为80.83，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 3组孕鼠胎盘滋养细胞Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平比较（±s）

表4 3组孕鼠胎盘滋养细胞Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平比较（±s）

注：与生理盐水组比较，1）P＜0.05；与中药组比较，2）P＜0.05。

组别中药组生理盐水组空白对照组Bax 1.17±0.021）0.92±0.05 0.97±0.042）鼠数12 12 12 Bcl-2 0.43±0.031）0.63±0.12 0.65±0.032）

2.4 3组孕鼠外周血HCG、ALT 和AST 水平比较3组孕鼠的外周血ALT 值水平比较，F值0.83，差异均无统计学意义（P＞0.05）；3 组孕鼠的外周血AST 值水平比较，F值为1.43，差异均无统计学意义（P＞0.05）；3 组孕鼠的外周血HCG值水平比较，F值为34.46，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 3组孕鼠外周血HCG、ALT和AST水平比较（±s）

表5 3组孕鼠外周血HCG、ALT和AST水平比较（±s）

注：与生理盐水组比较，1）P＜0.05；与中药组比较，2）P＜0.05。

AST/（U/L）148.83±8.81 156.92±17.54 150.92±7.60组别中药组生理盐水组空白对照组鼠数12 12 12 HCG/（mU/mL）63.67±3.851）71.00±9.16 71.75±7.202）ALT/（U/L）52.75±3.65 54.50±4.02 52.83±3.59

3 讨论

在妊娠过程中，胎盘最早形成，是母胎交换的惟一器官，对妊娠期胚胎的发育和生长起到至关重要的作用［11］。滋养细胞作为胎盘的重要组成细胞，与胎盘的形成及其功能密不可分。外周血HCG 主要由胎盘滋养层细胞分泌，血HCG 水平越高，反映滋养层细胞活力越强，胎盘与母体连接可能越紧密。滋养细胞的凋亡受多通路、多因素影响，受细胞内多个因子的调控［12］。Bcl-2 蛋白家族对细胞凋亡有重要调节作用，该家族主要由促凋亡的Bax、Bak、Bad 和抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w 组成，Bcl-2 和Bax 是相互对立的一对基因，参与细胞凋亡的调控。Bcl-2 是一种原癌基因，位于18 号染色体q21，有3 个外显子；其产物是分子量26 kDa 的蛋白质，能够阻止或延迟细胞凋亡，延长细胞寿命。Bax是一种凋亡调控基因，定位于19 号染色体q133-q134，含有6 个外显子，基因全长45 bp，可以加速细胞凋亡。Bcl-2 高表达，凋亡指数低，可以抑制细胞凋亡；Bax 高表达，凋亡指数高，可以促进细胞凋亡；二者主要通过调节线粒体膜的通透性来调节细胞活性，进而在细胞的凋亡过程中起重要作用［13-16］。滋养细胞凋亡异常是多种胎盘相关性疾病发生的机制，其中，胎盘增生及植入的发生的机制之一是滋养细胞的凋亡被抑制［17］。

本次实验结果显示，中药组孕鼠胎盘数量低于生理盐水组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组孕鼠外周血HCG 值水平低于生理盐水组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。这表明产妇康煎剂可有效降低孕鼠外周血HCG 值水平，其机制可能与产妇康煎剂可破坏孕鼠胎盘结构，从而影响血HCG 产生相关。3 组孕鼠外周血ALT 值和AST 值水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明产妇康煎剂对妊娠大鼠无明显肝细胞损害。中药组胎盘组织中Bcl-2 mRNA 表达量低于生理盐水组和空白对照组，且Bax mRNA 表达量高于生理盐水组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；生理盐水组和空白对照组Bcl-2 和Bax mRNA 表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。同时，中药组胎盘组织中Bcl-2 蛋白相对表达水平低于生理盐水组和空白对照组，且Bax 蛋白相对表达水平高于生理盐水组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；生理盐水组和空白对照组Bcl-2 和Bax 蛋白表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。以上表明产妇康煎剂可以加速孕鼠胎盘滋养细胞的凋亡与坏死。

综上所述，产妇康煎剂可抑制孕期大鼠胎盘的生长和发育，降低血中HCG 水平，促进大鼠胎盘的凋亡，其机制可能与上调Bax表达和下调Bcl-2表达有关，从而促进胎盘组织的消散。这一发现为今后的研究奠定了良好的基础，有深入研究的必要。