基于TLR4/NF-κB信号通路探讨葛根黄连黄芩汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制

许瑶瑶，蔡巧燕，2，赵春雨，贾沛芝，王美玲，林 炜，2，张 铃，2*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

溃疡性结肠炎是一种原因不明的以直肠、结肠黏膜非特异性炎症、溃疡形成为主的病变。临床主要症状有腹痛、腹泻、里急后重、黏液脓血便［1-3］。临床研究表明，与普通人相比溃疡性结肠炎患者患结肠癌的风险是普通人的6～8 倍［4］，因此早期干预对减缓结肠炎相关性结肠癌的发生至关重要。溃疡性结肠炎在古代文献中并无确切的病名，可与中 医“泄 泻”“痢 疾”“肠 风”“便 血”“休 息 痢”等 对应［5］。张仲景在《伤寒论·太阳病脉证并治》中提：“太阳病，桂枝证，医反下之，利遂不止，脉促者，表未解也。喘而汗出者，葛根黄连黄芩汤主之。”［6］表明葛根黄连黄芩汤主治下利。目前已有大量文献报道葛根黄连黄芩汤在临床上被广泛地用于肠道疾病的治疗，例如溃疡性结肠炎、肠易激综合征、结直肠癌等［7-10］。Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一种在肠道固有免疫中起重要作用的模式识别受体，通常在溃疡性结肠炎的结肠组织中高表达［11］；当TLR4受到外源刺激时，可激活NF-κB 的磷酸化，促使其入核，而NF-κB 作为免疫调节过程中的重要转录因子，其活化可增加促炎细胞因子的表达，最终加剧溃疡性结肠炎的发生、发展［12］。本研究拟从TLR4/NF-κB 信号通路探讨葛根黄连黄芩汤对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 6 周龄SPF 级C57BL/6 雄性小鼠20 只，体质量（22±1）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，在福建中医药大学实验动物SPF 级动物实验室适应性喂养1 周，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007，饲养条件为温度湿度恒定，每天给予光照12 h。本研究方案经福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（审批号：2W202201 1 2022197）。

1.2 实验药物 葛根黄连黄芩汤，组方：葛根24 g，黄连9 g，黄芩9 g，炙甘草6 g。4 味药物饮片均购自河北安嘉药业有限公司，药材均已按国家中药饮片炮制规范进行炮制。

1.3 实验试剂 DSS（美国MPMatenals 公司，批号：216011 090）；Phospho-NF-κB p-P65 抗体（批号：3033S）、NF-κB P65 抗体（批号：8242S）均购自美国CST 公司；TLR4 抗体（批号：66350-1-Ig）、GAPDH抗体（批号：60004-1-Ig）、Vinculin 抗体（批号：66305-1-Ig）、Goat Anti-Mouse IgG（H+L）-HRP conjugate 抗体（批号：SA00001-1）、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）-HRP conjugate 抗体（批号：SA00001-2）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；苏木素染色液（批号：G1140）、伊红染色液（批号：G1100）均购自北京索莱宝科技有限公司；免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，批号：Kit-0017）；便隐血（OB）试剂（珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA-2020B）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：R211-02）；SYBR®Select Master Mix kit（美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号：4472908）；ELISA 试剂盒小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）（批号：MM-0040M1）、小鼠白细胞介素-6（IL-6）（批号：MM-0163M1）、小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（批号：MM-0132Ml）均购自江苏酶免实业有限公司。

1.4 实验仪器 低温高速离心机（美国Sigma-Aldrich 公司）；酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；电泳仪、电泳槽、转膜装置、全自动凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；全自动石蜡切片机（德国徕卡仪器公司）；生物组织石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；光学显微镜（德国徕卡仪器公司）；荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；形态学显微图像采集与分析系统（厦门市麦克奥迪实业集团有限公司）。

2 实验方法

2.1 药物制备 按照8∶3∶3∶2 的比例取4 种中药饮片葛根、黄芩、黄连、炙甘草。先将药物浸泡于8 倍量超纯水中30 min，再回流提取，提取时间为1 h。等提取结束后，用纱布过滤药液，再次加入等体积量的超纯水，煎煮时间为1 h。结束后，再次加入等量的超纯水量，煎煮1 h。等待3 次提取结束后，将药液旋蒸浓缩为1 g/mL 葛根黄连黄芩汤药液，用于后续实验。

2.2 造模和分组 将20 只C57BL/6 小鼠按照随机数字表法分为空白组、中药组、模型组、模型＋中药组，每组5 只。适应性喂养7 d 后开始造模。模型组和模型＋中药组连续7 d 给予2.5% DSS 水自由饮用（注：每隔1 d 配制新鲜的2.5% DSS 水），7 d 后换蒸馏水饮用4 d。造模11 d，中药组及模型＋中药组给予葛根黄连黄芩汤，灌胃剂量为2 g/（kg·d）。空白组及模型组给予生理盐水灌胃。

2.3 观察指标

2.3.1 4组小鼠体质量及疾病活动指数评分计算 实验期间每天记录小鼠体质量，同时采用疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分法观察4 组小鼠体质量、粪便黏稠度、粪便潜血的变化。① 质量减轻评分：0≤体质量下降百分比＜1%，评0 分；1%≤体质量下降百分比＜5%，评1 分；5%≤体质量下降百分比＜10%，评2 分；10%≤体质量下降百分比＜15%，评3 分；体质量下降百分比≥15%，评4 分。② 粪便黏稠度评分：正常大便成形，评0 分；大便松散，评2 分；腹泻，评4 分。③ 粪便潜血评分：肉眼可见无血便，评0 分；隐血阳性，评2 分；显性出血，评4 分。

DAI＝（体质量减轻评分＋粪便黏稠度评分＋粪便潜血评分）/3

2.3.2 4 组小鼠结肠组织整体性状观察及长度测量 实验结束后，隔天取材。采用脱颈法处死小鼠，取4 组小鼠结肠组织，平铺于一次性滤纸上，观察4 组小鼠结肠组织性状的差异，同时做好标记并测量4 组小鼠结肠组织的长度，取材过程中将小鼠结肠组织进行拍照，测量从盲肠到肛门这一段结肠的长度，随后将其收集保存。

2.3.3 4 组小鼠结肠组织病理学形态观察 结肠组织从肛门位置起剪为3 段，所有结肠取靠近肛门端一段约0.5～0.8 cm 长度组织放于4%多聚甲醛溶液中固定，其余2 段组织将放入离心管中并立即放入液氮，随后转移到-80 ℃超低温冰箱用于Western blot 和qPCR 实验。采用梯度脱水法包埋组织，将结肠组织石蜡包埋块切成厚度为4 μm 的切片，进行HE 染色，在光学显微镜下进行拍照。

2.3.4 Western blot 检测4 组小鼠结肠组织中TLR4、p-P65、P65 蛋白表达量 结肠组织裂解后离心收集蛋白，并使用BCA 法进行浓度测量。经变性、电泳、转膜、封闭后分别加入相应抗体TLR4、p-P65、P65（1∶1 000），摇床上4 ℃孵育过夜。一抗回收，将条带置于二抗GAPDH、Vinculin（1∶5 000）中室温孵育1.5 h。洗涤后，加入ECL 显影液，用全自动化学发光成像系统（ChemiDoc XRS System）进行显影，最后使用Image J 软件进行灰度值分析。

2.3.5 免疫组化法分析4 组小鼠结肠组织中p-P65的蛋白定位及阳性表达率 将结肠石蜡块切成厚度为4 μm 的切片，脱蜡后进行抗原修复，然后按照免疫组化试剂盒说明书进行操作。DAB 染色，苏木素染核，树脂封片并拍照，采用Image J 软件分析系统对棕色颗粒（阳性表达）进行半定量分析。

2.3.6 qPCR 法检测4 组小鼠结肠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表达水平 提取4 组结肠组织总RNA，用NanoDrop2000 超微量分析仪测定RNA 浓度。利用 HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit 将总RNA 逆转录为cDNA。采用SYBR®Select Master Mix kit 和IL-1β、IL-6、TNF-α 引物进行扩增，以GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCt方法计算4 组结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.3.7 ELISA 法检测4 组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量 从-80 ℃冰箱中取出4 组血清，试剂盒置于室温下平衡30 min。按要求加样、温育、洗涤、显色、终止，利用全自动酶标仪检测450 nm 下的OD 值，以标准曲线计算样品中小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的浓度，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件处理。计量资料符合正态分布以（±s）表示，2 组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 4组小鼠体质量及DAI 评分的比较 空白组和中药组在实验期间，体质量呈现逐步上升趋势，且2 组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，模型组小鼠体质量从第9 天起显著下降（P＜0.05）；经葛根黄连黄芩汤干预后，在第11 天模型＋中药组小鼠体质量较模型组则有所增加（P＜0.05）。在DAI 评分方面，空白组和中药组间差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组小鼠的评分从第6 天起则显著高于空白组（P＜0.05）；与模型组比较，模型＋中药组的DAI 评分从第9 天起显著降低（P＜0.05）。见图1。

图1 4 组小鼠体质量及DAI 评分的比较

3.2 4组小鼠结肠组织整体性状及长度比较 空白组及中药组小鼠结肠组织黏膜表面光滑，无充血、水肿，无糜烂及溃疡形成；模型组小鼠结肠组织的肠壁增厚，黏膜呈弥漫性充血、水肿，广泛糜烂；而模型＋中药组小鼠结肠组织的损伤程度则明显改善。4 组结肠组织长度统计分析显示：空白组及中药组小鼠结肠组织长度差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，模型组的结肠组织长度明显缩短（P＜0.05）；与模型组比较，模型＋中药组的结肠长度则显著增加（P＜0.05）。见图2。

图2 4 组小鼠结肠组织整体性状及长度的比较

3.3 4组小鼠结肠组织病理学形态 空白组和中药组小鼠结肠黏膜较为完整，杯状细胞排列整齐，无炎症细胞浸润；与空白组对比，模型组黏膜糜烂严重，杯状细胞排列紊乱；与模型组对比，模型＋中药组黏膜糜烂程度明显减轻，正常杯状细胞也明显增多，且炎症浸润明显减少。见图3。

图3 4 组小鼠结肠组织HE 染色图（×200）

3.4 4组小鼠结肠组织中TLR4、p-P65 及P65 的蛋白表达量比较 空白组与中药组间的TLR4 的蛋白表达量、p-P65/P65 差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，模型组中的TLR4、p-P65/P65 的蛋白表达量则显著升高（P＜0.05）；经葛根黄连黄芩汤干预后，模型＋中药组中的TLR4、p-P65/P65 的蛋白表达量较模型组显著减少（P＜0.05）。见图4。

图4 4 组小鼠结肠组织中TLR4、p-P65 及P65 蛋白表达量比较

3.5 4组小鼠结肠组织中p-P65 的蛋白定位及相对表达量比较 当TLR4 受到外源刺激时，P65 被磷酸化后，能入核作为转录因子，调控下游促炎因子的表达。为了进一步验证p-P65 的入核，采用免疫组化法检测该蛋白定位及蛋白表达量。空白组与中药组间小鼠结肠组织中p-P65 的阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，模型组小鼠结肠组织中p-P65 的阳性表达率显著升高（P＜0.05），且入核数量增加；与模型组比较，模型＋中药组小鼠结肠组织中p-P65 的阳性表达率显著降低（P＜0.05），且入核数量减少。见图5。

图5 4 组小鼠结肠组织中p-P65 的阳性表达比较（×400）

3.6 4组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平比较 qPCR 结果显示：空白组与中药组间IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，模型组中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，模型＋中药组中的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平则显著降低（P＜0.05）。见图6。

图6 4 组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平比较

3.7 4组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比较见表2。

表2 4 组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比较（±s）

表2 4 组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

TNF-α/（ng/L）433.31±42.13 426.43±60.89 630.25±69.361）427.87±40.812）组别空白组中药组模型组模型＋中药组n4 4 4 4 IL-1β/（ng/L）79.70±7.85 82.72±3.01 102.37±12.781）81.24±4.112）IL-6/（pg/mL）44.64±3.44 44.65±7.70 67.62±13.041）47.43±4.892）

4 讨 论

溃疡性结肠炎是一种以局部组织损伤、肠道菌群失调、结肠炎症为特征的疾病［13-14］。溃疡性结肠炎主要表现为结肠中异常的炎症反应以及免疫微环境内稳态的失调［15］。西医对溃疡性结肠炎还不能起到完全治愈的效果，且易引起胃肠道反应的毒副作用。中医药对于治疗炎症性疾病具有较大的优势，通过多个药物活性成分和多靶点来进行预防治疗，具有协同作用，且不良反应小。本次研究发现，葛根黄连黄芩汤可以显著改善DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠充血水肿情况，促进结肠黏膜的修复，从而减轻小鼠腹泻、便血等症状，证明了葛根黄连黄芩汤对溃疡性结肠炎具有保护作用。

葛根黄连黄芩汤由葛根、黄芩、黄连、炙甘草4 味药物组成，具有解热、抗菌、抗炎、抗病毒、解痉、抑制胃肠运动、抗缺氧、抗心律失常、增强机体免疫功能等药理作用［16］。现代药理研究发现，葛根黄连黄芩汤主要化学成分包括葛根素、黄芩苷、小檗碱、甘草酸等，上述成分均能发挥抗炎和免疫调节等作用［17-20］。葛根素能显著抑制内皮细胞中NF-κB 磷酸化和细胞上清中TNF-α 的分泌，从而抑制炎症反应的加剧［21］。黄芩苷、甘草酸在炎症反应中也能起到很好的抑制作用［22-23］。小檗碱是一种能从多种植物中分离得到的生物碱，抗炎作用显著［24］。以上研究均可作为葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎提供理论依据及物质基础。

在经典的DSS 急性和慢性结肠炎小鼠模型中TLR4 基因表达增加［25］，而NF-κB 是炎症性疾病的关键调节剂［26-27］，异常炎症导致肠道内促炎和抗炎细胞因子之间的动态平衡被打破，进而对结肠组织造成不可逆转的病理性损害。本研究结果表明，DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中p65 被磷酸化后激活，且入核数量增加，随之结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达水平显著升高，提示经DSS诱导后小鼠结肠组织中发生了明显的炎症反应。在葛根黄连黄芩汤干预后能显著抑制DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中P65 磷酸化及入核、以及促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表达水平。这些结果均表明葛根黄连黄芩汤可能通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路，进而降低DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的炎症反应，从而减轻结肠损伤。但葛根黄连黄芩汤含有多种中药活性成分，但对溃疡性结肠炎免疫调节的机制、通路、具体作用靶点仍未明确。因此，今后需要从这些方面进行深入探讨，以期为葛根黄连黄芩汤的临床应用提供实验依据。