UPLC-MS/MS 法同时测定补中益气丸（水丸）中6 种化合物含量

2023-11-13田小权张加稳

云南中医学院学报 2023年5期

田小权，张加稳，王葳

（1.昆明市药品不良反应与药物滥用监测中心，云南昆明 650000；2.昆明市食品药品检验所，云南昆明 650000；3.云南中医药大学，云南昆明 650500）

补中益气丸是由李东垣精心钻研的《脾胃论》中的名方补中益气汤制成的丸剂，由炙黄芪、炙甘草、炒白术、党参、当归、陈皮、柴胡和升麻等组成，主要功效为补中益气、升阳举陷[1-3]。研究表明，补中益气丸中有效成分很多，主要包含黄酮类、皂苷类、挥发油、氨基酸及多糖类等[4]，具有抗氧化、抗炎、心血管和神经保护等生理活性[5-6]。中药的药理作用是多个组分在药效上的协同作用，强调药物之间的整体作用，故中药质量评价应对处方中多个有效组分的含量进行定量分析考察。目前，2020 版《中国药典》第一部收载了补中益气丸（水丸）的质量标准，对制剂中的甘草、当归、陈皮进行薄层色谱定性分析，对黄芪甲苷单组分含量测定做了质量控制以及对炙黄芪、炙甘草、炒白术、陈皮、党参、升麻和柴胡进行显微鉴别，对其药效质量的分析评价存在局限性[7-8]。

现有文献报道多是采用高效液相色谱（highperformance liquid chromatography-tandem，HPLC）法测定补中益气丸中的活性成分含量[9]，该法同时测定多种化合物时常遇到基质干扰大、易出现假阳性、分离效果差，以及耗时较长等问题。近年来，超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra-high-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）法已发展成为测定药物中多组分有机物微量分析的重要方法[10]。鉴于对补中益气丸（水丸）中多种活性成分含量同时测定的文献报道较少，本文建立UPLC-MS/MS 法同时测定黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷等6 种化合物组分含量，旨在为该制剂的药效质量分析评价提供理论指导。

1 仪器与材料

超高效液相-串联质谱联用仪（EXION-QTRAP 4500，美国AB 公司），超声提取仪（SK8210HP，上海科导公司），十万分之一电子天平（MS205DU 型，梅特勒-托利多Mettler Toledo 公司），Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 色谱柱（填料:十八烷基硅烷键合硅胶2.1 × 100 mm，1.8 μm，美国Agilent 公司）；PES滤膜（0.22 μm，天津津腾有限公司）。黄芪甲苷（批号:110781-202118）、毛蕊异黄酮苷（111920-201606）、橙皮苷（批号:110721-202019）、阿魏酸（批号:110773-201915）、甘草酸（100551-202003）、甘草苷（批号:111610-201908）对照品均由中国食品药品检定研究院提供。补中益气丸（水丸）由同药集团大同制药有限公司制作，批号:171002。甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，默克股份两合公司）。

2 方法与结果

2.1 仪器条件

2.1.1 液相色谱条件流速:0.35 mL/min；柱温:40 ℃；进样量:10 μL；流动相A 为5 mmol/L 乙酸铵水溶液，流动相B 为甲醇（含0.1%甲酸）。洗脱梯度见表1。

表1 洗脱梯度

2.1.2 质谱条件正、负离子扫描；MRM 多反应监测；气帘气、离子源雾化气、离子源辅助加热气分别设定为38 psi、55 psi 及55 psi，喷雾电压为5 500 V，加热器温度为550℃；优化后的监测离子对（m/z）、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）等结果参数见表2。

表2 6 种化合物的MRM 质谱参数[11]

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取各标准品约10 mg，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度均为1.0 mg/mL 混合标准储备液；分别精密量取适量储备液混合置容量瓶中，以70%甲醇溶液稀释，制得标准品系列溶液，避光4 ℃保存备用。

2.2.2 供试品溶液取本品适量，研细至粉末状，精密称取0.5 g，将其置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，紧密封塞，摇匀，称定重量，将超声仪温度调至30 ℃，超声45 min，待锥形瓶冷却至室温后，补足重量，摇匀，过滤，精密量取25 mL，置100 mL 容量瓶中，70%甲醇定容至刻度线，即得供试品溶液。

2.3 线性关系考察所测成分的定量下限（LLOQ）要求信噪比S/N＞10，6 次进样，计算平均峰面积精密度RSD≤10%。根据样品含量预实验测定，选择6 个浓度的混合对照品溶液重复进样（n=2），以目标物定量离子对的平均峰面积计算进样质量浓度（ng/mL）得线性回归方程。6 种化合物的标准混合液和样品液的MRM 离子图分别见图1 和图2，回归方程线性范围、相关系数（r2）及LLOQ 见表3。结果显示，在相应浓度范围内各化合物线性关系良好（r2为0.994～0.999）。

图1 6 种化合物标准液的MRM 质谱图

图2 样品液中6 种化合物的MRM 质谱图

表3 6 种化合物的线性范围、r2 和定量下限

2.4 精密度试验取质量浓度为50 ng/mL（中浓度）的混合对照品溶液，连续进样6 次，测定黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷6 种化合物的平均峰面积，依次为2 189、5 616、3 471、3 187、3 288、7 364，计算得6 种化合物平均峰面积的RSD 分别为1.7%、2.3%、4.1%、5.6%、4.7%、3.8%。

2.5 重复性试验按照“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，分别测定得到样品中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷6 种化合物含量的RSD 分别为5.3%、7.5%、6.7%、8.3%、6.0%、4.2%，结果呈现良好的方法重复性。

2.6 稳定性试验取浓度为100 ng/mL 的混合标准品溶液，依次进样测定存放第0、2、4、8、12、24、48 h的溶液中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷峰面积的RSD，结果分别为1.2%、2.5%、1.8%、3.2%、1.5%、0.9%，表明总体稳定性良好，但阿魏酸稳定性略偏低，可能是试样前处理时被氧化。

2.7 加样回收试验称取已测定的补中益气丸约0.5 g，精密加入低、中、高3 种质量浓度的储备混合液适量，每组平行6 份，按照“2.2.2”项下方法制备，依次测定各组分含量，计算回收率。结果显示黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷的平均回收率分别为98.4%、101.7%、101.4%、86.7%、103.5%、93.7%，对应的RSD 在3.8%～7.6%之间。

2.8 样品含量测定称取补中益气丸（水丸）供试品约0.5 g，按“2.2.2”项方法制备6 份供试液，分别分析供试品中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、橙皮苷、阿魏酸、甘草酸和甘草苷的平均含量。结果见表4。

表4 供试品中6 种组分的含量测定结果

3 讨论

3.1 供试品溶液制备根据补中益气丸（水丸）中6 种化合物组分的提取效率，对提取方法作了优化研究：比较了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、纯甲醇对供试液中6 种化合物提取效率的高低，结果表明70%甲醇更高，且峰形更好，原因可能是各化合物极性与该比例提取溶剂相近，流动相洗脱效率更高；比较了对供试液超声10 min、20 min、30 min、45 min、60 min，结果表明超声45 min 和60 min 提取效率明显更高，但两者无明显差异，故选择超声时间为45 min。

3.2 色谱条件优化依据化合物性质和色谱条件，研究对比了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸铵-水、甲醇-甲酸-水、含0.1%甲酸的甲醇-乙酸铵-水组成的流动相体系的洗脱效果。结果表明，经优化后含0.1%甲酸的甲醇-乙酸铵-水混合体系对6 种化合物的洗脱效果更好，峰形对称、分离度高。对超高效液相色谱柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18、MAbPac SCX-10 和ProPac Elite WCX 进行分析，比较色谱峰形和分离度，结果显示经Agilent Zorbax Eclipse XDBC18 洗脱峰形更好，且出峰时间最短。