三种植物精油和纯露在沐浴露和洗手液中的抑菌抗氧化性能研究

王 莹 王新炎 许钰爽 杨立伟 刘晨曦 贾 陆 刘 伟 薛 刚 *

1.南阳理工学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳，473000；2.河南华牧生物科技有限公司，河南南阳，473300；3.河南京科国草药业有限公司，河南南阳，473043；4.郑州大学药学院，河南郑州，450002

随着人们消毒防护和卫生安全意识的不断增强，具有抑菌/抗菌功效的特种洗手液和沐浴露备受消费者欢迎[1-5]。目前市售抑菌洗手液和沐浴露产品主要是添加三氯生、三氯卡班等化学合成抑菌剂，这些成分不仅对人体有毒副作用，还有潜在的致癌作用。传统的化学抑菌剂已经不能满足消费者对于安全的追求[6-9]。天然抑菌成分因其毒性低和价格低廉的优势，已从传统的食品添加剂推广应用到日化产品行业。添加中草药等天然提取物的洗手液及沐浴露，不仅温和不刺激，而且安全可靠，符合人类倡导的天然健康理念。

牛至精油具有较强的抗菌和抗氧化活性。有研究[10]表明牛至精油对DPPH自由基和ABTS自由基均有较强的清除能力，且清除能力都优于化学合成的抗氧化剂BHT。牛至精油具有抗菌、杀菌、抗球虫和增强机体特异性免疫的功效已有文献报道[11-12]。迷迭香精油具有很好的抑菌效果[13]和较强的自由基清除能力[14]。目前迷迭香精油已被广泛应用于食品、农产品、医药和化妆品等多个领域[15]。艾草精油具有抗菌、抗病毒和抗氧化作用[16]。而作为天然的抑菌抗氧化剂，牛至、迷迭香、艾叶挥发油本身就有独特的色泽和香味，因此相关产品中无需再加色素和香精，可以使产品更安全简便，节约成本[17]。纯露是在蒸馏萃取精油的过程中水蒸气冷凝下来的副产品，含有少量精油成分及活性物质，同样具有良好的抗菌、驱虫、保健作用[18]。

本文以牛至、迷迭香、艾草精油和纯露为抑菌成分，制备绿色沐浴露和洗手液，并与添加传统抑菌抗氧化剂三氯生、醋酸氯己定和尼铂金乙酯的化学沐浴露和洗手液[19]进行抑菌和抗氧化性能的比较，为企业生产以牛至、迷迭香和艾草精油和纯露为原料，制备添加天然抗氧化剂的绿色洗手液和沐浴露提供参考依据，为降低日化产品中化学抑菌抗氧化剂的毒性、致癌等危害，发挥天然抑菌抗氧化剂高效抑菌、抗氧化性和低毒性等优势提供支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

本实验所用牛至精油和纯露由河南华牧生物科技有限公司提供，迷迭香精油、迷迭香纯露、艾草精油、艾草纯露由河南京科国草药业有限公司提供。异Vc钠、维生素E、丁基羟基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）、三氯生、醋酸氯己定、尼铂金乙酯及所用主要试剂三氯乙酸、磷酸氢二钠、过氧化氢、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

主要仪器包括：752N紫外可见分光光度计（上海精科实业有限公司），TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂），BSA224S-CW电子天平（Sartorius中国有限公司），NDJ-5S数字式黏度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）等。

1.2 实验方法

1.2.1 洗手液的制备

称取一定量的片碱置于一定量的纯净水中，加热搅拌溶解2～5 min至透明后，加入HVS搅拌溶解5 min至透明。缓慢加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（AES），边加边升温，30 min升温到70 ℃。加入α-烯基磺酸钠（AOS）、磺酸、三甲基甘氨酸及一定量的抑菌抗氧化剂，搅拌，加入1,3-丁二醇、CAB-35和Co-40，调和，加入1,3-二羟甲基-5,5二甲基海因（DMDMH）及食盐，搅拌均匀，制得洗手液产品。

1.2.2 沐浴露的制备

称取一定量的片碱置于一定量的纯净水中，加热搅拌溶解2～5 min至透明后，加入HVS搅拌溶解5 min至透明。缓慢加入AES，边加边升温，30 min升温到70 ℃。加入AOS、磺酸、三甲基甘氨酸及一定量的抑菌抗氧化剂，搅拌，加入羟丙基三甲基氯化铵、CAB-35和Co-40，调和，加入DMDMH及食盐，搅拌均匀，制得沐浴露。

1.2.3 原料及产品的抗氧化活性测定

采用DPPH法测定原料及产品对DPPH·自由基的清除能力[20]，计算其清除率及IC50。

采用普鲁士蓝法测定原料及产品的还原力[21]，用BHT做对照，用BHT当量即每克样品中含有相当BHT的毫克数来表示样品还原力（mg/g）。

采用水杨酸法测定原料及产品对羟自由基的清除能力，计算其清除率[22]。

1.2.4 产品抑菌试验

（1）滤纸片法抑菌试验：采用混合接菌法移取不同浓度的菌悬液于培养皿中，倒入培养基凝固后，将灭菌、浸有待测样液的滤纸片贴在培养基表面，滤纸间距离适中，同时用无菌水进行空白对照实验，每组3次重复，测定其抑菌圈直径，判断产品对于供试菌种的抑制程度[23-24]。抑菌圈直径的判断标准：抑菌圈直径（包含滤纸片直径5 mm）大于15 mm为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，7～9 mm为不敏感，抑菌圈小于7 mm或无抑菌圈表示无抑菌作用。

（2）产品抑菌率试验：采用悬液定量实验法[25]，参照GB 15979—2002[26]中的悬液法检验产品抑菌率。将各个菌种培养液用无菌水稀释成10-5的菌悬液，将无菌水稀释成体积分数为50%的洗手液和沐浴露样液2.0 ml和一定浓度的菌悬液2.0 ml置于灭菌后的离心管中，充分摇匀，使其充分作用1 min，将该反应液以混合接菌法接种至相应的培养皿中，恒温培养。对照组用蒸馏水代替，培养一定时间后采用平板菌落计数法统计菌落数，按公式1计算抑菌率。

公式中：X为抑菌率（%）；A为空白组菌落数；B为实验组菌落数。

评价标准：抑菌率≥90%，产品有抑菌作用[21]。

（3）现场手消毒试验：参照GB 15979—2002[26]及文献[27]，选择志愿者进行现场消毒试验。将手的四指在冷却凝固的培养皿中按压一下，立刻盖上培养皿，即为对照样品。使用制作的沐浴露或洗手液产品将手指洗干净，待自然晾干后迅速在培养皿上按压四指，立刻盖上培养皿，即为被试样品。置于恒温培养箱中培养24 h后，记录对照样品和被试样品中的菌落数量，按照公式2计算抑菌率。

公式中：X为抑菌率（%）；A为对照样品平均菌落数；B为被试样品平均菌落数。

评价标准：抑菌率≥90%，产品有抑菌作用。

2 结果与分析

2.1 滤纸片法测定抑菌性能

将所得沐浴露和洗手液产品进行适当稀释后，浸泡滤纸片，并贴于采用混合接菌法移取不同浓度菌悬液的培养皿中，培养后测定其抑菌圈直径，结果见表1。测定添加化学抑菌剂的沐浴露和洗手液产品的抑菌圈大小见表2。

表1 添加精油或纯露的沐浴露和洗手液产品抑菌圈大小

表2 添加化学抑菌剂的沐浴露和洗手液产品的抑菌圈大小

表1数据结果显示：不同原料加量的沐浴露和洗手液产品抑菌圈大小差异不明显。牛至纯露加量在5%～15%时对三种菌的抑菌圈＞15 mm，为高度敏感，其中抑菌圈大小顺序为铜绿假单胞菌＞大肠埃希菌＞白念珠菌。迷迭香纯露加量在1%～15%时，对三种菌的抑菌圈＞15 mm，为高度敏感，抑菌圈大小顺序为铜绿假单胞菌＞大肠埃希菌＞白念珠菌，其中加量为5%时对白念珠菌的抑菌圈为7～9 mm，为低度敏感。艾草纯露加量在1%～15%时，对三种菌的抑菌圈＞15 mm，为高度敏感，抑菌圈大小顺序为大肠埃希菌＞铜绿假单胞菌＞白念珠菌，加量在1%～10%时对白念珠菌为低度敏感，10%～15%加量时为中度敏感。

表2数据结果显示：添加三氯生、醋酸氯己定和尼泊金乙酯浓度大于0.03%时对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的抑菌圈＞20 mm，为极度敏感；对白念珠菌抑菌圈为10 mm，为中度敏感。由此可见各化学抑菌剂的抑菌性能大小顺序为三氯生＞醋酸氯己定＞尼泊金乙酯，确定添加量为0.03%。

2.2 抑菌率法测定抑菌性能

对牛至、迷迭香和艾草精油和纯露最小添加量的洗手液和沐浴露产品及化学抗菌剂产品进行加水稀释至50%，分别与一定浓度的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白念珠菌菌悬液混合后，采用稀释混合平板法进行抑菌率实验。结果见表3。

表3 各产品对供试菌种的抑菌率

抑菌率实验结果显示：浓度稀释为50%的产品对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白念珠菌的抑菌率均超过了50%，说明产品中加入的天然抗菌剂和化学抗菌剂对三种供试菌种均有显著的抑菌作用。

2.3 现场手消毒实验

产品原液50%浓度稀释液作为试验样液，对于大肠埃希菌的抑菌率实验，原液体积分数25%浓度的稀释液作为试验样液，对于白念珠菌的抑菌率实验，原液体积分数25%浓度的稀释液作为试验样液，对于铜绿假单胞菌的抑菌率实验。选择10人进行现场手消毒实验，计算出消毒率。结果见表4。

表4 产品的抑菌率实验及现场手消毒实验结果

现场手消毒实验结果显示洗手液和沐浴露产品对人体表面细菌都有明显的抑菌效果，其中牛至精油抑菌率为76.6%效果最显著，除艾草精油和艾草纯露的洗手液和沐浴露抑菌率在50%以下，其他均在50%以上。

2.4 产品抗氧化活性测定

采用DPPH法、普鲁士蓝法和水杨酸法测定添加植物精油、纯露和化学抑菌剂的沐浴露、洗手液产品抗氧化活性，见表5。

表5 洗手液和沐浴露产品的抗氧化活性测定结果

由表5知，沐浴露产品清除DPPH·能力排序为：醋酸氯己定＞尼泊金乙酯＞迷迭香精油＞牛至精油＞艾草精油＞三氯生＞牛至纯露＞迷迭香纯露＞艾草纯露；还原力大小排序为：醋酸氯己定＞尼泊金乙酯＞三氯生＞牛至精油＞迷迭香精油＞艾草精油＞牛至纯露＞迷迭香纯露＞艾草纯露；·OH清除能力大小排序为：牛至精油＞迷迭香精油＞迷迭香纯露＞牛至纯露＞艾草精油＞艾草纯露＞醋酸氯己定＞三氯生＞尼泊金乙酯。添加醋酸氯己定的沐浴露产品清除DPPH·能力和还原力最强，添加植物精油和纯露的沐浴露产品具有与化学抑菌抗氧化剂沐浴露产品相当的抗氧化能力，如添加0.03%三氯生所制备的沐浴露与添加0.4%牛至精油的沐浴露产品清除DPPH·的能力相近。

洗手液产品清除DPPH·能力排序为：牛至精油＞迷迭香精油＞醋酸氯己定＞艾草精油＞尼泊金乙酯＞牛至纯露＞迷迭香纯露＞三氯生＞艾草纯露；还原力大小排序为：牛至精油＞迷迭香精油＞醋酸氯己定＞艾草精油＞尼泊金乙酯＞牛至纯露＞迷迭香纯露＞三氯生＞艾草纯露；·OH清除能力大小排序为：迷迭香精油＞牛至精油＞醋酸氯己定＞艾草精油＞尼泊金乙酯＞牛至纯露＞迷迭香纯露＞三氯生＞艾草纯露。洗手液中以添加0.4%的牛至精油或迷迭香精油的产品抗氧化性最强。

3 结论

（1）采用滤纸片法对添加植物精油、纯露及化学抗氧化剂的洗手液和沐浴露进行抑菌实验，结果表明牛至纯露加量在5%～15%时对三种菌的抑菌圈＞15 mm，为高度敏感，其中抑菌圈大小顺序为铜绿假单胞菌＞大肠埃希菌＞白念珠菌。迷迭香纯露加量在1%～15%时，对三种菌的抑菌圈＞15 mm，为高度敏感，抑菌圈大小顺序为：铜绿假单胞菌＞大肠埃希菌＞白念珠菌，其中加量为5%时对白念珠菌的抑菌圈为7～9 mm，为低度敏感。艾草纯露加量在1%～15%时，对三种菌的抑菌圈＞15 mm，为高度敏感，抑菌圈大小顺序为：大肠埃希菌＞铜绿假单胞菌＞白念珠菌，加量在1%～10%时对白念珠菌为低度敏感，10%～15%加量时为中度敏感。

（2）通过抑菌率实验得出加入0.4%植物精油与0.03%化学抑菌剂的洗手液和沐浴露产品抑菌效果相当。

（3）通过对比不同产品抗氧化性的测定结果，添加醋酸氯己定的沐浴露产品清除DPPH·能力和还原力最强，添加植物精油和纯露的沐浴露产品具有与化学抑菌抗氧化剂沐浴露产品相当的抗氧化能力，如添加0.03%三氯生所制备的沐浴露与添加0.4%牛至精油的沐浴露产品清除DPPH·的能力相近。添加0.4%的牛至精油或迷迭香精油的洗手液产品抗氧化性强于添加化学抑菌抗氧化剂的洗手液产品。