基于网络药理学与分子对接技术探讨四氢姜黄素对肝细胞癌作用的分子机制

包卓聪,王庆庆,贾 辉,陆 瑶,时 娜,张 艳

0 引言

肝癌作为一种最为普遍的恶性肿瘤之一,其发病率在全球范围内排名第五,而死亡率高居全球第三[1]。肝癌包括原发性肝癌和继发性肝癌,其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,全世界每年约有50万新发病例[2-3]。手术切除肿瘤及肝脏移植为当前主要治疗手段,但其复发几率大,手术难度大,肝源不足,预后差[4]。因此,通过非手术方法治疗中晚期肝癌是重要的补充手段[5]。目前,中药成为抗肿瘤新药研发的新方向[6]。姜黄素(Curcumin,CUR)是从姜科属植物姜黄的根茎中提取的主要活性成分。研究表明,姜黄素具有调节细胞周期、抑制肿瘤发生和转移的活性,其对正常细胞的毒性较低,副作用较小,并且姜黄素还具有抑制HCC生长、侵袭转移、血管生成及抑制肝星状细胞活性、乙肝病毒表达复制的作用[7],因此,成为潜在的肿瘤干预药物的选择。

四氢姜黄素(Tetrahydrocurcumin,THC)是姜黄素在体内主要的活性代谢产物,自然存在于姜黄中,其结构上缺乏α,β-不饱和羰基部分[8]。四氢姜黄素的结构决定了其独特和特异性的分子机制,从而使其成为预防和治疗癌症的潜在候选药物。研究表明,姜黄素可以抑制多种癌症细胞。姜黄素在肝脏中被内源性还原酶系统还原为四氢姜黄素和六氢姜黄素[9-11]。与姜黄素不同,四氢姜黄素在各种pH值的盐水和磷酸盐缓冲液中具有稳定性[12]。与姜黄素相比,四氢姜黄素因其较好的化学稳定性和生物利用度,以及与姜黄素的结构高度相似,成为开发癌症预防和治疗药物的有价值的先导化合物[13]。

网络药理学通过系统生物学、生物信息学和多方面药理学等跨学科理论,揭示了疾病、基因、靶标和药物之间的复杂网络关系[14-15],能够更加准确地找到药物的治疗靶点。网络药理学强调通过多途径调控信号通路来改善药物治疗效果、减少毒副作用以提高新药临床试验成功率、节约药物研发费用等[16]。网络药理学已成为一种筛选治疗靶标的快速、有效、经济的方法[14]。本研究应用网络药理学的研究手段,在系统层次上,以生物网络为总体视角,解析四氢姜黄素与肝细胞癌之间的分子关联规律,分析预测药物靶标机制,分子对接技术验证成分与靶点的相互作用,为其后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 收集和筛选与四氢姜黄素相关的靶点 本次实验利用小分子结构的相似性来预测药物分子的靶点,并且以文献检索进行补充,从而确定THC的作用机制。首先以“Tetrahydrocurcumin”为关键词检索并下载四氢姜黄素的3D化学结构,存储为mol2格式并上传至SwissTargetPrediction[17](http://www.swisstargetprediction.ch)中进行成分靶点预测,下载预测结果,下载完成后,针对所得到的结果进行筛选,以“概率”值大于0进行筛选。此外,通过探索PubMed数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)中以“Tetrahydrocurcumin”为关键字的文献,补充了其他潜在的四氢姜黄素靶标。最终,经过UniProt数据库(http://www.uniprot.org)的处理,所有的靶标名称均已被转化为基因符号。对所获得的靶点进行综合汇总,并进行去重处理。检索时间自建库至2022年10月。

1.2 收集和筛选与肝细胞癌相关的靶点 利用Genecards数据库[18](https://www.genecards.org/)、OMIM数据库[19](https://omim.org/),以关键词“Hepatocellular carcinoma”进行检索,在Genecards数据库中,疾病靶点的筛选条件为相关性得分值≥2倍的中位数,合并去重后,获取肝细胞癌疾病相关靶点。检索时间自建库至2022年12月。

1.3 四氢姜黄素与肝细胞癌共同靶点的筛选以及网络模型的构建 利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)[20]在线韦恩图分析工具,将四氢姜黄素药物靶点与肝细胞癌疾病靶点导入,绘制韦恩图,以获取共同的治疗靶标,将交集靶点作为四氢姜黄素治疗肝细胞癌的潜在靶点,并且采用Cytoscape 3.9.1软件包,对整理获得的四氢姜黄素、肝细胞癌等相关靶点信息建立网络以及进行可视化处理,得到“四氢姜黄素-靶点-肝细胞癌”网络。

1.4 靶蛋白互作PPI网络的构建与核心靶点的筛选 将四氢姜黄素与肝细胞癌共同靶点导入String数据库[21](https://www.string-db.org/),设置物种为Homo sapiens,其他参数保持默认,获得其PPI网络信息,将其导入Cytoscape3.9.1软件[22],使用Centiscape插件[23]对其进行网络拓扑分析,以度值(Degree)、中介中心性(Betweenness)和接近中心性(Closeness)作为参考值,选出疾病的核心靶点。

1.5 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析 将获得的四氢姜黄素和肝细胞癌的核心靶点导入到Metascape (https://metascape.org)[24]在线富集分析平台中,并将该物种设置为“Homo sapiens”,然后进行GO功能和KEGG通路富集分析,以获得生物过程、细胞组分、分子功能和代谢途径。对这些数据进行保存,并利用微生信在线可视化处理网站(http://www.bioinformatics.com.cn)进行可视化呈现。检索时间自建库至2023年3月。

1.6 通过分子对接技术对活性成分和核心靶点进行对接 将四氢姜黄素分子与筛选关键靶点进行半柔性分子对接和结合构象打分。在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[25]和PDB数据库(https://www.rcsb.org/)[26]中,分别下载THC的2D结构sdf格式的文件和度值(Degree)较高的核心靶点蛋白的PDB格式文件,然后使用ChemBio3D软件将活性成分sdf格式文件转化为mol2格式文件,并进行能量最小化处理[27]。将以上文件一并导入Sybyl2.0软件[28],以提取靶点蛋白中的配体小分子,并且进行去除水分子和加氢等处理,随后进行分子对接,并利用打分函数进行评估。制作分子对接示意图时,选择高分结合构象的对接结果绘制。

2 结果

2.1 四氢姜黄素与肝细胞癌靶点筛选与交集靶点的获取及网络关系图的构建 经过筛选,成功确定114个四氢姜黄素的作用靶点,同时发现2 361个与肝细胞癌相关的靶点。共有77个靶点是重叠于药物作用和疾病相关的靶点。通过对数据进行分析和总结,建立重叠靶点的韦恩图(见图1)。77个交集靶点作为四氢姜黄素治疗肝细胞癌的潜在靶点,对潜在靶点信息进行网络构建以及可视化处理,其“四氢姜黄素-靶点-肝细胞癌”网络如图2所示。

图1 四氢姜黄素和肝细胞癌靶点韦恩图

图2 四氢姜黄素-靶点-肝细胞癌网络关系图

2.2 靶蛋白互作PPI网络的构建与核心靶点的筛选 通过将77个靶点蛋白信息上传至STRING平台并进行PPI网络分析,获得靶点蛋白之间的相互作用关系,并将其导入Cytoscape 3.9.1进行可视化处理,以节点表示靶点,以边表示各靶点之间的相互作用关系。在去除2个孤立节点后,构建一个PPI网络,其中包含了77个节点和767条相互作用连线。PPI网络如图3所示。利用Centiscape插件进行网络拓扑学分析,以Degree、Betweenness和Closeness为筛选条件,筛选出16个核心靶点,这些靶点的相关拓扑参数见表1。随着数值的增加,PPI网络中该节点的重要性也增加,其在生物学功能方面的作用也可能随之增强[29]。随着面积的增大,Degree值也呈现出逐渐增大的趋势(图3)。

表1 四氢姜黄素与肝细胞癌核心靶点及拓扑参数

图3 四氢姜黄素与肝细胞癌交集靶点蛋白互作PPI网络构建

2.3 GO功能富集分析 GO功能富集分析的结果包括495条生物学过程(BP),19条细胞组分(CC)和39条分子功能(MF)。根据P值排序,随着P值的增大和颜色的变红,所代表的富集程度也随之增加。分别挑选出排名前10的富集结果作为气泡图,由图4可见,核心靶点所涉及到的与癌症相关的生物学过程主要有酶联受体蛋白信号通路(Enzyme-linked receptor protein signaling pathway)、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路(Transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、细胞对氧水平降低的反应(Cellular response to decreased oxygen levels)等,细胞组分主要涉及到膜阀(Membrane raft)、内吞囊泡(Endocytic vesicle)、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物(RNA polymerase II transcription regulator complex)等,分子功能主要包括转录因子结合(Transcription factor binding)、核受体活性(Nuclear receptor activity)、蛋白激酶结合(Protein kinase binding)等。

图4 四氢姜黄素与肝细胞癌核心靶点GO富集分析气泡图

2.4 KEGG通路富集分析 据KEGG通路富集分析结果所示,涉及核心靶点的通路数量高达97条。根据P值排序,随着P值的增大和颜色的变红,所代表的富集程度也增加,因此,需要对前30位进行筛选并绘制气泡图(见图5)。涉及的信号通路中,癌症的通路(Pathways in cancer)、化学致癌受体激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、PI3K-AKT信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等均与HCC相关,并且四氢姜黄素可能对前列腺癌(Prostate cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、结直肠癌(Colorectal cancer)、乳腺癌(Breastcancer)等具有治疗作用。

图5 四氢姜黄素与肝细胞癌核心靶点KEGG富集分析气泡图

2.5 分子对接 为了验证药物和筛选的16个核心靶点的结合活性,我们通过分子对接技术对中药成分和蛋白靶点进行对接验证。将经过筛选的16个核心靶点与THC进行分子对接,以Total Score≥5的打分函数为阈值,结合自由能越小,配体与受体的结合越稳定,Total Score值越大,表明活性成分与靶点蛋白的结合效果较好,Total Score>7则表明结合活性极强[30]。表2中呈现了分子对接的结果。根据实验结果,四氢姜黄素成功地与16个核心靶点实现了精准对接。四氢姜黄素与PIK3CA、KDR、EGFR、MMP9、HSP90AA1、STAT3、PPARG、MTOR、AR均有强烈的结合活性,并且与AKT1、TP53、CASP3、MDM2、ESR1、HIF1A结合活性较好,与SRC的结合活性一般。PIK3CA靶点蛋白与四氢姜黄素的对接反应评分最高。分子对接示意图见图6。THC通过9个氢键嵌入在PIK3CA的TYR836、VAL851、SER854、ASP810等氨基酸残基所形成的疏水性口袋中,结合活性强。

表2 四氢姜黄素与核心靶点分子对接评分

图6 四氢姜黄素与PIK3CA分子对接示意图

3 讨论

20世纪90年代以来,中药抗癌药物逐渐成为抗肿瘤药物研发的新方向[31]。2022年,Chen[32]等通过研究姜黄素治疗HCC,证实了药物通过AMPK/ULK1自噬通路对肝癌细胞产生影响。肝脏是体内能量代谢的主要场所,AMPK是能量代谢的主要传感器。糖酵解是肝肿瘤细胞产生能量的基本过程。AMPK可以通过抑制糖酵解来治疗HCC。实验结果表明,姜黄素可以通过p53途径促进细胞凋亡,并通过AMPK/ULK 1途径促进自噬,从而降低肝癌细胞HepG 2的存活率,达到治疗肝癌的目的[32]。研究表明,姜黄素口服生物利用度低,经历广泛的代谢后,血液中姜黄素浓度低,但其仍然具有抗癌作用,表明可能是姜黄素代谢物在体内仍有药理作用[33-34]。四氢姜黄素作为体内主要的姜黄素代谢产物,具有较好的化学稳定性和生物利用度以及与姜黄素的高度结构相似性。尽管四氢姜黄素缺乏α,β-不饱和羰基部分,但是其以不同的酮-烯醇形式和其他类似物方式存在[35],这些类似物可能是四氢姜黄素具有不同于姜黄素的功能和作用机制的原因之一。

本研究通过小分子结构相似性进行靶点预测,并结合文献进行相关药物靶点补充,找到16个四氢姜黄素治疗肝细胞癌的潜在核心作用靶点,包括AKT1、CASP3、MDM2、KDR、PIK3CA、STAT3、TP53、EGFR等。经过GO富集分析和KEGG信号通路富集分析,结果表明,这些靶点主要分布于转录调节复合物、膜阀、内吞囊泡等部位,并且具有与转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶结合等功能,参与细胞对化学压力的反应、细胞对有机氮化合物的反应及细胞对氧含量降低的反应等多种生理过程,参与调控PI3K-AKT信号通路,参与在癌症中PD-L1的表达以及PD-1检查点信号通路、HIF-1等信号通路,这些均表明,THC可作用于多个靶点和通路,以达到抑制HCC的效果。THC与多个核心靶点蛋白的分子对接结果呈现出较高的结合力和结合活性,验证了此结论。血管内皮生长因子是介导肿瘤血管生成的主要物质[36],KDR所编码的蛋白是血管内皮生长因子受体-2(Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)[37]。研究表明,在植入肝癌细胞系HepG2异种移植瘤的BALB/c-裸鼠中,每天口服3 000 mg/kg四氢姜黄素,可显著降低肿瘤组织内的毛细血管密度[38]。在分子水平上,四氢姜黄素触发线粒体依赖性级联反应,p53上调并降低MDM2以诱导细胞凋亡[39]。分子对接结果也同样显示,四氢姜黄素能与KDR、TP53以及MDM2靶点蛋白稳定结合。

本研究采用网络药理学方法,对四氢姜黄素进行了潜在的靶点预测和信号通路分析,从多角度探讨其在预防和治疗肝细胞癌方面的潜在作用机制。利用分子对接技术,验证了药物成分与各核心靶点的结合活性。目前,四氢姜黄素治疗肝细胞癌的相关研究报道很少,本研究主要通过生物信息学分析方法对四氢姜黄素在肝细胞癌肿瘤细胞中表达情况及信号转导途径进行深入预测,为继续研究四氢姜黄素抗肝细胞癌作用的潜在靶点提供了理论参考,同时为现代分子生物学技术验证四氢姜黄素对抗肝细胞癌的作用及分子机制提供了依据,有助于深入了解四氢姜黄素抗肝细胞癌作用的分子机制,从而为临床肝细胞癌治疗提供参考。