基于UPLC-Q/TOF-MS的甘草酸单铵和甘草酸二铵在大鼠体内移行成分表征

虞 娉,庄让笑,席建军,何亮亮

(1. 杭州市西溪医院药学部,浙江 杭州 310023;2. 暨南大学药学院中药及天然药物研究所,广东 广州 510632)

甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎,具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药等功效[1-3],是我国传统中药临床最常用中药材,素有“十药九草”之称[4]。甘草化学成分复杂,主要有黄酮类、皂苷类和二苯乙烯类等化合物,其中皂苷类化合物—甘草酸是其主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节等多种生物活性[5-8]。甘草酸单铵和甘草酸二铵作为甘草酸的主要衍生物,是临床上一线抗炎保肝药物[9],目前对两者的研究多集中于药理作用机制、药动学以及药剂学等方面的研究[10],然而,两者口服后在体内的代谢产物和代谢途径尚不清晰。

药物功效作用的发挥是其体内成分与机体两个复杂系统间的相互作用结果,体内药效物质(包括原型和代谢物)在不同靶点上的结合及在不同靶点之间的协同作用,构成了药物药效学机制的科学内涵;而阐明药物功效作用模式的必要因素之一是了解药物成分在体内的吸收、分布、代谢和排泄等特征,因此体内代谢产物研究是阐明药效物质基础和体内作用模式的重要途径[11]。研究表明,药物代谢酶介导的成分体内代谢是机体处置药物成分的一个重要过程,在体内Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶作用下,药物进入机体后可能发生多种代谢反应,药物结构随之改变,进而影响机体多种生理功能[12]。因此,对甘草酸单铵和甘草酸二铵的体内代谢轮廓进行研究具有重要的临床意义。

超高效液相色谱-四极杆/飞行时间高分辨质谱技术(ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry,UPLC-Q/TOF-MS)具有高准确性、高分辨率等特点,作为快速筛选和鉴定复杂样品中成分的有效分析技术在药物、毒品和食品代谢产物鉴定方面被广泛使用[11]。综上,本研究采用UPLC-Q/TOF-MS结合质量残差过滤技术,对甘草酸单铵和甘草酸二铵在大鼠体内的代谢轮廓进行了表征,探讨其可能的代谢途径,为进一步揭示两者发挥功效作用的物质基础及药效作用机制提供实验基础和依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及材料UPLC-Q/TOF-MS:ACQUITYTMI-Class超高效液相色谱仪,SYNAPTTMG2 HDMS四极杆飞行时间质谱仪(美国Waters公司);色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1×100 mm,1.8 μm,Ireland),配备Waters VanGuardTM预柱(美国Waters公司)。超声波清洗器(昆山,KQ3200E);Sigma台式高速冷冻离心机(3K-15);电子天平(Sartorius,BP 211D);高速离心机(Anke TGL-16G-A)。质谱级纯净水、乙腈、甲醇购于美国Thermofisher公司;质谱级甲酸购于美国Sigma Aldrich公司;甘草酸单铵与甘草酸二铵(Fig 1,购买自成都克洛玛,纯度均≥95%)。

1.2 实验动物与给药方案SPF级雄性SD大鼠15只(250±20)g,购自广东省医学实验动物中心(SCXK粤2022-0002)。饲养温度控制在20±2 ℃,光照时间每天12 h(8 ∶00～20 ∶00),光照时间模拟昼夜交替,可以自由饮水和进食。适应性喂养1周后,随机分成3组:(1)甘草酸单铵给药组(n=5),(2)甘草酸二铵给药组(n=5),(3)空白对照组(n=5)。给药前所有大鼠禁食12 h,甘草酸单铵与甘草酸二铵都以纯净水溶解,给药组均以50 mg·kg-1的剂量(化合物质量/大鼠体质量)连续灌胃给药3 d,空白组灌胃给予相同体积的纯净水。

1.3 生物样本采集及前处理方法血浆样本的收集及前处理:末次灌胃给药后,分别于0.5、1、2、4、8 h采集各组大鼠的肝门静脉血置于用肝素钠润洗的EP管中,14 000 r·min-1离心10 min,取上清液即得血浆样品。分别取上述各时间点大鼠血浆1 mL,均匀混合后加3倍体积乙腈沉淀蛋白,涡旋2 min,14 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液至室温氮气吹干,残渣加200 μL甲醇复溶,14 000 r·min-1离心10 min,取上清液2 μL进样分析。

尿液和粪便样本的收集及前处理:收集给药期间大鼠的尿样和粪样,将当天收集到尿样4 000 r·min-1离心10 min,合并各组每天的尿样,保存在-80 ℃冰箱中。前处理时,将上述各组尿样(6 mL)在室温下解冻,氮气流吹干,残渣加6 mL纯水复溶,上样活化后的SPE小柱,分别用5%甲醇-水、甲醇洗脱,收集甲醇洗脱馏分,室温氮气吹干,加1 mL甲醇复溶,14 000 r·min-1离心10 min,取上清液2 μL进样分析。各组采集的粪样室温下风干后,取1 g置于50 mL锥形瓶中,加10倍体积甲醇冷浸12 h,超声60 min,14 000 r·min-1离心10 min,取上清液室温下氮气吹干,加6 mL水复溶,上样活化后的SPE小柱,分别用2%甲醇-水、甲醇洗脱,收集甲醇洗脱馏分,室温氮气吹干,残渣用1 mL甲醇复溶,14 000 r·min-1离心10 min,取上清液2 μL进样分析。

脑组织:分别将采集的各时间点脑组织用生理盐水洗涤干净,滤纸吸干表面水分,称重后加2倍体积生理盐水搅匀。分别各取约2 mL脑组织匀浆于10 mL EP管中,加入3倍量甲醇-乙腈(1 ∶1,V/V)混合溶液,涡旋2 min,14 000 r·min-1离心10 min,合并同一组的上清液,室温下氮气吹干,残渣加200 μL甲醇复溶,14 000 r·min-1离心10 min,取4 μL进样分析。

1.4 UPLC-Q/TOF-MS分析条件UPLC分析在配备有二元溶剂系统,自动进样器的Acquity UPLC I-Class系统上进行(Waters Corporation)。采用BEH RP C18柱,在40 ℃柱温下实现色谱分离。流动相由水(A)和乙腈(B)组成,二者均包含0.1%甲酸(V/V)。以0.4 mL·min-1的流速进行梯度洗脱,洗脱程序如下:5% B,0～0.5 min; 5～80% B,0.5～10 min; 80%～100% B,10～12 min; 100% B,12～13 min; 100%～5% B,13～14 min; 5% B,14～15 min。UPLC系统与四极杆飞行时间质谱仪串联。

质谱采用电喷雾离子源(electrospray ion source,ESI),毛细管电压3 kV(ESI+)或-2.5 kV(ESI-),锥孔电压30 V(ESI+)或40 V(ESI-),二级锥孔电压4 V,源温100 ℃,脱溶剂气温度300 ℃,反吹气流速50 L·h-1,脱溶剂气流速800 L·h-1,氩气为碰撞气,在MSE模式中,氩被用作CID的碰撞气体;在MS/MS模式中,根据不同化合物结构类型设定相应的碰撞能量。质谱扫描范围为50～1200 Da,以甲酸钠溶液校正质量轴,以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度(正离子模式m/z556.277 1,负离子模式m/z554.261 5)。数据采集为centroid 模式。

1.5 数据分析数据分析由MassLynx(V4.1,Waters Corporation,Milford,MA)进行。元素组成的预测规则如下:分析时间为 0～15 min,质量残差过滤窗口的最大公差设置为10×10-12;目标物质量数波动窗口 0.1 Da,质量数变化范围-300～500 Da,相对强度设为5%;不饱和度设置在5～15的范围内;碳、氢、氧、氮和硫的原子数分别设置在0～60、0～80、0～30、0～5和0～2的范围内;空白样品用作对照,与分析样品进行比较,目标物与空白样本匹配保留时间波动范围0.1 min,峰面积大于5倍以上,采用质量残差过滤技术用于分析体内移行成分。

2 结果

2.1 基于质量残差过滤技术的体内移行成分分析步骤质量残差指化合物精确分子质量与整数质量之间的差值。多数情况下,药物Ⅰ相代谢物的质量残差值基本能落在相对于母体药物质量残差的±50 mDa 之内,Ⅱ相代谢产物在相对于母体药物质量残差的±70 mDa 之内。因此,通过设定较窄的质量残差范围可以在数据后处理过程中过滤复杂的背景信号,便于快速识别相应的代谢产物峰。为了探究甘草酸单铵、甘草酸二铵在大鼠体内的代谢轮廓,本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技术,分别采集了甘草酸单铵、甘草酸二铵及空白样本中脑组织、血浆、尿液和粪样的高分辨质谱数据(同一类型生物样本的质谱数据连续采集),数据后处理分析过程如下:(1)采用Waters公司的MassLynx 4.1数据分析平台中的MetaboLynx XS数据处理模块,首先导入MetaboLynx Acq Format代谢物分析模板,在模板的Mass A类别中分别以甘草酸单铵、甘草酸二铵及甘草次酸为母核输入分子式;在模板的Mass A类别中设置甘草酸单铵、甘草酸二铵样本数据为Analyte,而对照组的样本为Control;在模板的Process类别中选择MetaboLynx进行数据分析;基于2.5前述内容,在Setup中进行参数的设置,其中代谢类型如Tab 1所示。(2)在上述设置的基础上,分别运行不同生物样本类型的数据处理模块,软件基于设置的代谢类型进行残差过滤分析,从而获得相应的可能的代谢产物。(3)在MetaboLynx XS数据处理模块Browser中开展代谢物的分析工作,在获得的大样本数据中通过以下规则进行代谢物的进一步过滤,即PPM小于10,峰面积大于50,Status为Found。(4)基于皂苷母核的质谱裂解规律,对过滤的代谢物进行进一步的鉴定分析。

2.2 甘草酸单铵在大鼠体内的移行成分分析通过上述基于质量残差过滤技术的体内移行成分分析步骤,在甘草酸单铵灌胃给药大鼠的脑组织、血浆、尿液和粪样的样本中共获得186个可能的移行成分(以甘草次酸为母核)。进一步对这186个可能的成分进行解析,获得甘草酸单铵在大鼠体内代谢物共20个(Tab 1)。

大鼠经灌胃给予甘草酸单铵后,未在相应的生物样本中发现原型成分甘草酸单铵的暴露,推断甘草酸单铵主要以代谢物的形式存在于体内。代谢物M18在高分辨质谱中出峰时间为tR=8.29 min,[M+H]+准分子离子峰为m/z=471.3482,判断其分子式为C30H46O4;m/z=453.333 8及435.322 3分别是脱去18 Da(H2O)而形成的,表明代谢物M18结构中含有-OH基团,而m/z=407.331 9为进一步脱去-CO形成的片段,提示M18含有-COOH基团,结合皂苷的特征片段m/z=317.212 9及271.204 6,进一步通过与对照品比对,确定代谢物M18为甘草次酸(glycyrrhetinic acid)。同样代谢物M19是甘草次酸的同分异构体。代谢物M9在高分辨质谱中的出峰时间为tR=6.63 min,其[M+H]+准分子离子峰为m/z=647.379 8,通过元素分析判断其分子式为C36H54O10,其子离子m/z=471.346 0为M9脱去1个葡萄糖醛酸形成的片段,结合其他碎片,判断M9为甘草次酸结合1个葡萄糖醛酸的产物,因此,代谢物M19应为单葡萄糖苷甘草酸。同理,代谢物M4([M+H]+,m/z=823.410 3)为甘草酸(Fig 2)。

Fig 1 The chemical structure of monoammonium glycyrrhizinate (A) and diammonium glycyrrhizinate (B)

Tab 1 Identification of transitional components of monoammonium glycyrrhizinate and diammonium glycyrrhizinate in rat under condition of UPLC-Q/TOF-MS (ESI+)

代谢物M6、M7、M13和M15的[M+H]+准分子离子峰均为m/z=487.342 3,相比甘草次酸多16 Da,子离子m/z=469.329 7,451.322 4和405.313 8等分别为脱水或脱羧基的片段,结合m/z=317.211 9和271.206 7皂苷的特征片段,推断M6,M7,M13和M15应为甘草次酸的氧化产物。相似地,M2、M3、M5和M10的[M+H]+准分子离子峰都为m/z=503.337 3,为甘草次酸的双氧化产物。代谢物M8、M11和M16的[M+H]+准分子离子峰为m/z=485.325 2,与甘草次酸的氧化产物少2H,结合其子离子片段m/z=467.316 3,439.324 0,317.213 7,271.205 9等信息,可推断出代谢物M8、M11和M16为具有皂苷母核的多羟基结合物,其结构应为甘草次酸的氧化脱氢产物。同理,代谢物M12和M14([M+H]+,m/z=501.3216)为甘草次酸双氧化及脱氢产物,M20([M+H]+,m/z=469.3318)为甘草次酸的脱氢产物。

代谢物M1的出峰时间为tR=4.32 min,母离子为m/z=528.368 8,通过元素分析其分子式应为C32H48NO5,相比甘草次酸,其结构中多了一个C2H4NO的片段(甘氨酸),子离子m/z=317.215 4及271.202 2为特征的皂苷碎片;子离子m/z=469.334 0是M1脱去C2H4NO及2H之后形成的片段,推断该片段应该是甘草酸经脱氢后与甘氨酸结合形成的,因此M1是甘草次酸甘氨酸结合物。代谢物M17出峰时间为7.89 min,[M+H]+准分子离子峰m/z=457.331 3,相比甘草次酸少一个CH2片段,m/z=439.321 7及317.209 2提示为皂苷类化合物,因此M17应是甘草次酸的脱甲基产物。

Fig 2 Mass fragmentation pathways of glycyrrhizic acid by UPLC-Q/TOF-MS (ESI+)

2.3 甘草酸二铵在大鼠体内的移行成分分析通过前述分析方法,在甘草酸二铵灌胃给药大鼠的各生物样本中共获得173个可能的移行成分(以甘草次酸为母核)。进一步对其可能的成分进行解析,获得代谢物共20个(Tab 1)。研究发现甘草酸单铵和甘草酸二铵在体内具有相似的代谢特征,所鉴定的20个代谢物都能在甘草酸单铵里面被分析得到;同样地,本研究也发现,大鼠经过灌胃给药甘草酸二铵后,未在大鼠体内相应的生物样本中发现原型成分甘草酸二铵的暴露,甘草酸二铵主要以代谢物的形式存在于体内。

2.4 甘草酸单铵和甘草酸二铵在大鼠体内的代谢物分布差异Fig 3,4结果显示,大鼠灌胃给药甘草酸单铵或者甘草酸二铵后,在体内都未发现相对应的原型成分,两者在体内主要以代谢物——甘草次酸的形式存在。其可能的原因是甘草酸单铵及甘草酸二铵是盐类化合物,灌胃给药后迅速水解,导致在生物样本中未检测出相应的原型成分。

甘草酸单铵和甘草酸二铵在大鼠体内的脑组织,血液和粪样中都鉴定得到了相类似的代谢物,而在尿液中甘草酸二铵具有更加丰富的代谢物暴露,而甘草酸单铵只鉴定得到2个代谢物(M4和M9)。推测导致此结果的原因可能与原型化合物的极性有关,甘草酸二铵结构中含有两个铵基,其极性较甘草酸单铵的极性大,而大极性化合物更容易被肾组织排泄,因此,其通过肾脏排到尿液中的代谢物更加丰富。

在脑组织中,代谢产物甘草次酸是唯一一个可以透过血脑屏障的成分,这可能与甘草次酸脂溶性较大有关。此外,甘草酸单铵或者甘草酸二铵在临床上主要用于肝炎的治疗,严重的肝病会分泌致病因子引起以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的综合征,即肝性脑病,而甘草酸单铵或者甘草酸二铵在脑组织中的暴露成分甘草次酸具有良好的抗炎等活性,提示甘草酸单铵或者甘草酸二铵具有治疗肝性脑病的可能性。

在粪样中鉴定出一系列高暴露的Ⅰ相代谢物,而Ⅰ相代谢物由于氧化还原等反应,其与活性密切关联,因此,Ⅰ相代谢物往往收到更多的重视,在粪样中高暴露的Ⅰ相代谢物提示其可能会影响肠道菌群,这表明在解释甘草酸单铵或者甘草酸二铵的药效可以关注对肠道菌群的影响。

在所有的生物样本中,我们都发现了甘草次酸的暴露,由于甘草次酸为Ⅰ相代谢产物,具有合适的脂溶性,提示其可能是甘草酸单铵或者甘草酸二铵体内发挥药效的关键药效成分。

3 讨论

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技术对甘草酸单铵或者甘草酸二铵在大鼠体内的移行成分进行了全面的分析鉴定。本研究在正负离子模式下,对甘草酸单铵及甘草酸二铵体内移行成分进行了检测分析,发现在正离子模式下能覆盖所有负离子检识得到的代谢物信息,且响应普遍高于负离子模式,因此本研究的数据以正离子模式呈现。甘草酸单铵或者甘草酸二铵进入机体后,在大鼠的脑组织、血浆、尿液、粪便中均未发现了其原型,两者主要以代谢物的形式存在于生物体中。本研究一共鉴定了20个甘草酸单铵及甘草酸二铵相关的代谢产物,两者在体内的代谢物类型基本一致,其中两者分别在脑组织中检测到1个代谢物,血液中检测到12个代谢物,粪样中检测到16个代谢物;在尿液中甘草酸二铵的代谢产物较为丰富,共鉴定得到10个,而甘草酸单铵在尿液中的代谢物较少仅得到2个。上述结果提示,甘草酸单铵及甘草酸二铵主要通过肠道进行排泄。

Fig 3 Distribution of transitional components in rats of monoammonium glycyrrhizinate and diammonium glycyrrhizinate

Fig 4 Metabolic pathway of monoammonium glycyrrhizinate and diammonium glycyrrhizinate in vivo

甘草酸单铵及甘草酸二铵体内代谢途径显示,体内20个代谢产物主要分为Ⅰ相氧化还原反应及脱甲基化反应,而Ⅱ相代谢的葡萄糖醛酸化代谢主要发生在甘草酸单铵上。Ⅰ相代谢反应是甘草酸单铵及甘草酸二铵在体内的主要反应类型,主要是在原型化合物脱糖基后形成的甘草次酸的基础上发生一系列的氧化还原反应。在所有的生物样本中,我们均发现了甘草次酸的暴露,提示了其可能是甘草酸单铵或者甘草酸双铵在体内发挥药效的关键药效成分。

本研究利用UPLC-Q/TOF-MS技术阐述了甘草酸单铵及甘草酸二铵在大鼠体内的代谢轮廓,初步揭示两者在体内发挥功效作用的主要成分为甘草次酸,而且两者具有治疗肝性脑病的可能性;其次,可以通过肠道菌群的角度研究两者发挥功效作用的机制。本研究的不足之处在于对于代谢物的立体构型、官能团位置确定有限,后续进一步通过分离并结合核磁共振等分析手段技术,可更加准确的探究两者在体内的代谢特征。