葛根素通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路诱导人肾癌786-O 细胞凋亡的研究

竺东杰 邹 杰 余史丹 陈 潇 李红霞

肾癌是较常见的泌尿系恶性肿瘤，每年新确诊病例超过40 万，由于早期症状不典型致使约30%的患者确诊时已发展为中晚期[1-2]。目前，化疗仍是临床治疗中晚期肾癌的首选方案，但化疗药物副作用广泛且易诱发癌细胞耐药，是导致患者不能耐受和疗效不佳的主要原因[3]。肾癌属中医学“腰痛”“血尿”“积聚”等范畴，其病机在于虚实夹杂、正气不足、阴阳气血逆乱[4]。葛根具有解肌退热、升阳止泻、通经活络、透疹等功效。葛根素是从葛根中提取的一种异黄酮类化合物，研究证实，葛根素通过诱导细胞凋亡对非小细胞肺癌[5]、前列腺癌[6]、甲状腺癌[7]等具有抑制作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β（PI3K/Akt/GSK-3β）信号通路对肿瘤细胞凋亡具有重要调控作用[8]。本实验以人肾癌786-O 细胞为受试细胞，研究葛根素对肾癌细胞凋亡的影响，并基于PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路探讨其机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细 胞 人肾癌786-O 细胞株购自中国科学院典型培养物保存委员会细胞库（批号SCSP-5059）。

1.2 药物与试剂 葛根素、胰蛋白酶消化液、CCK-8试剂盒、ECL 发光液（上海叶源生物科技有限公司，批号S20446、R40001、R22305、R30199）；PI3K 抑制剂LY294002（美国Sigma 公司，批号L9762）；RPMI 1640 培养基（美国Hyclone 公司，批号2022G0609007）；链青霉素双抗、胎牛血清（美国Gibco 公司，批号15237-109、24118-031）；Annexin V-FITC/PI 双染试剂盒（北京索莱宝生物科技公司，批号CA1020）；PI3K、磷酸化PI3K（Tyr317）[p-PI3K（Tyr317）]、Akt、磷酸化Akt（Ser473）[p-Akt（Ser473）]、GSK-3β、磷酸化GSK-3β（Ser21）[p-GSK-3β（Ser21）]、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）和IgG 二抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-2067R、bs-5570R、bs-6951R、bs -0876R、bs -0023R、bs -5368R、bs -5241R、bs -0081R、bs-20352R、bs-4564R、bs-0294P）。

1.3 主要仪器 240i CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；MR4100 型酶标仪（美国Dynatech 公司）；E1100 型电泳仪、Tetra 型转印系统（美国Bio-Rad 公司）；CyFlow Counter 型流式细胞仪（德国Partec 公司）；B30142 型低温高速离心机（美国Beckman 公司）。

1.4 细胞培养、分组与给药 复苏后的人肾癌786-O 细胞株以RPMI1640 培养基（添加10%胎牛血清和1%链青霉素双抗）于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养，细胞融合至约85%时，按1∶3 传代培养。取第4代对数生长期786-O 细胞，给予DMSO（空白对照组）、终浓度10、20、40 mg/L 的葛根素溶液[9]和终浓度15 mg/L 的LY294002 溶液[10]。LY294002 为PI3K 特异性抑制剂，设置LY294002 组以对照分析PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路在葛根素诱导786-O 细胞凋亡中的作用。

1.5 CCK-8 法检测细胞增殖抑制率 药物干预48 h后，经胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/L，按100 μL/孔转移至96 孔培养板，37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h 后，按10 μL/孔加10% CCK-8 溶液后培养2 h，胰蛋白酶消化后离心收集细胞，按照CCK-8 试剂盒操作说明，通过酶标仪检测吸光度值（A450 nm）并计算细胞增殖抑制率[（1-药物组A450 nm/空白对照组A450 nm）×100%]。独立重复3 次实验。

1.6 AnnexinV-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡率 药物干预48 h 后，应用不含乙二胺四乙酸二钠的胰蛋白酶进行消化，离心取细胞，按试剂盒说明，195 μL/孔加入结合液制备单细胞悬液，依次5 μL/孔加入AnnexinV-FITC 染色液和10 μL/孔加入PI 染色液，轻轻混匀后37 ℃避光孵育15 min，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。独立重复3 次实验。

1.7 Western blot 法检测蛋白表达 药物干预48 h后，应用胰蛋白酶消化，离心取细胞，加入RIPA 裂解液，冰上静置30 min 后4 ℃、12000 r/min 离心（离心半径8 cm）30 min 提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度并配平后，以30 μg 蛋白量上样，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、转印至聚偏二氟乙烯膜、5%血清白蛋白室温封闭1 h，一抗稀释液PI3K（1∶1000）、p-PI3K（Tyr317）（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（Ser473）（1∶1000）、GSK-3β（1∶800）、p-GSK-3β（Ser21）（1∶800）、Caspase-9（1∶1000）、Cleaved Caspase-3（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、βactin（1∶2000）4 ℃孵育过夜，洗膜后IgG 二抗稀释液（1∶3000）室温孵育1 h，洗膜后ECL 显色，通过ImageProPlus 软件分析条带灰度值，然后以β-actin 为内参计算蛋白相对表达量。独立重复3 次实验。

1.8 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，计量资料经检验均符合正态分布，采用均数±标准差（±s） 描述，多组间比较采用单因素χ2分析，方差齐用LSD-t 检验进行两两比较，方差不齐用Dunnett's T3 检验进行两两比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 葛根素对人肾癌786-O 细胞增殖抑制率的影响 与空白对照组比较，葛根素10、20、40 mg/L 组和LY294002 15 mg/L 组786-O 细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.01）；葛根素40 mg/L 组细胞增殖抑制率显著高于LY294002 15 mg/L 组（P＜0.05）。见表1。

表1 葛根素对人肾癌786-O 细胞增殖抑制率和凋亡率的影响（%，±s）

表1 葛根素对人肾癌786-O 细胞增殖抑制率和凋亡率的影响（%，±s）

注：LY294002 为磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂；与空白对照组比较，aP＜0.01；与LY294002 15 mg/L 组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别空白对照组葛根素10 mg/L 组葛根素20 mg/L 组葛根素40 mg/L 组LY294002 15 mg/L 组F 值P 值实验次数3 3 3 3 3细胞增殖抑制率3.47±0.53 17.04±2.92a 26.48±4.77a 42.79±6.81ab 35.73±6.12a 63.762＜0.001细胞凋亡率2.64±0.51 13.72±2.38a 30.41±4.05a 55.39±6.72ac 36.08±4.32a 117.935＜0.001

2.2 葛根素对人肾癌786-O 细胞凋亡的影响 与空白对照组比较，葛根素10、20、40 mg/L 组和LY294002 15 mg/L 组786-O 细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；葛根素40 mg/L 组细胞凋亡率显著高于LY294002 15 mg/L 组（P＜0.01）。见图1、表1。

图1 葛根素对人肾癌786-O 细胞凋亡的影响

2.3 葛根素对人肾癌786-O 细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路蛋白表达的影响 与空白对照组比较，葛根素20、40 mg/L 组和LY294002 15 mg/L 组786-O细胞p-PI3K（Tyr317）、p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser21）相对表达量显著降低（P＜0.01），PI3K、Akt、GSK-3β 相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05），p-PI3K（Tyr317）/PI3K、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK-3β（Ser21）/GSK-3β 比值显著降低（P＜0.01）。而葛根素40 mg/L 组与LY294002 15 mg/L 组比较，各指标间差异均无统计意义（P＞0.05）。见图2、表2。

表2 葛根素对人肾癌786-O 细胞PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路蛋白相对表达量的影响（±s）

表2 葛根素对人肾癌786-O 细胞PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路蛋白相对表达量的影响（±s）

注：PI3K 为磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K（Tyr317）为Tyr317 位点磷酸化PI3K；Akt 为蛋白激酶B；p-Akt（Ser473）为Ser473 位点磷酸化Akt；GSK-3β 为糖原合成酶激酶-3β；p-GSK-3β（Ser21）为Ser21 位点磷酸化GSK-3β；LY294002 为PI3K 抑制剂；与空白对照组比较，aP＜0.01

组别空白对照组葛根素10 mg/L 组葛根素20 mg/L 组葛根素40 mg/L 组LY294002 15 mg/L 组F 值P 值实验次数3 3 3 3 3 PI3K 1.12±0.27 1.09±0.29 1.06±0.25 1.10±0.28 1.08±0.29 0.065 0.992 p-PI3K（Tyr317）1.03±0.24 0.89±0.22 0.58±0.13a 0.32±0.07a 0.38±0.08a 36.159＜0.001 p-PI3K（Tyr317）/PI3K 0.92±0.28 0.81±0.24 0.55±0.15a 0.29±0.08a 0.34±0.09a 22.477＜0.001 Akt 0.96±0.22 0.95±0.24 1.03±0.24 1.01±0.25 0.97±0.23 0.211 0.931 p-Akt（Ser473）0.51±0.12 0.43±0.09 0.25±0.06a 0.09±0.03a 0.11±0.03a 43.297＜0.001组别空白对照组葛根素10 mg/L 组葛根素20 mg/L 组葛根素40 mg/L 组LY294002 15 mg/L 组F 值P 值实验次数3 3 3 3 3 p-Akt（Ser473）/Akt 0.53±0.14 0.45±0.12 0.24±0.07a 0.09±0.03a 0.11±0.04a 42.635＜0.001 GSK-3β 0.93±0.26 0.89±0.20 0.90±0.19 0.88±0.20 0.91±0.21 0.081 0.988 p-GSK-3β（Ser21）0.58±0.13 0.49±0.12 0.12±0.03a 0.07±0.02a 0.09±0.03a 69.328＜0.001 p-GSK-3β（Ser21）/GSK-3β 0.62±0.15 0.54±0.13 0.14±0.04a 0.08±0.03a 0.10±0.04a 58.713＜0.001

图2 葛根素对人肾癌786-O 细胞PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路蛋白表达的影响

2.4 葛根素对人肾癌786-O 细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响 与空白对照组比较，葛根素20、40 mg/L 组和LY294002 15 mg/L 组786-O 细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax 相对表达量显著升高而Bcl-2 相对表达量显著降低（P＜0.01），Bax/Bcl-2 比值显著升高（P＜0.01）；葛根素40 mg/L 组Cleaved Caspase-3、Bax 相对表达量和Bax/Bcl-2 比值显著高于LY294002 15 mg/L 组（P＜0.01），两组间Caspase-9、Bcl-2 表达差异均无统计意义（P＞0.05）。见图3、表3。

表3 葛根素对人肾癌786-O 细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2 比值的影响（±s）

表3 葛根素对人肾癌786-O 细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2 比值的影响（±s）

注：Caspase-9 为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；Cleaved Caspase-3 为激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bcl-2 为B 淋巴细胞瘤-2；Bax 为Bcl-2 相关X 蛋白；LY294002 为磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂；与空白对照组比较，aP＜0.01；与LY294002 15 mg/L 组比较，bP＜0.01

组别空白对照组葛根素10 mg/L 组葛根素20 mg/L 组葛根素40 mg/L 组LY294002 15 mg/L 组F 值P 值实验次数3 3 3 3 3 Caspase-9 0.17±0.04 0.20±0.05 0.37±0.08a 0.66±0.13a 0.58±0.11a 40.286＜0.001 Cleaved Caspase-3 0.11±0.03 0.14±0.05 0.25±0.06a 0.72±0.16ab 0.43±0.12a 46.287＜0.001 Bcl-2 0.48±0.12 0.40±0.10 0.31±0.08a 0.18±0.05a 0.21±0.07a 20.851＜0.001 Bax 0.08±0.02 0.22±0.06a 0.36±0.08a 0.62±0.12ab 0.20±0.05a 51.692＜0.001 Bax/Bcl-2 0.17±0.04 0.54±0.12a 1.16±0.27a 3.41±0.65ab 0.95±0.22a 73.754＜0.001

图3 葛根素对人肾癌786-O 细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响

3 讨 论

葛根素是中药葛根的主要活性成分，目前主要用于冠心病、心绞痛、小儿病毒性心肌炎、缺血性脑血管病、糖尿病等辅助治疗。随着药理学研究的深入，葛根素抗肿瘤活性逐渐得到关注，其中促进肿瘤细胞凋亡是其关键作用机制之一，但既往葛根素对肾癌细胞凋亡的影响及相关机制仍无定论。LY294002 为PI3K 特异性抑制剂，He 等[11]研究发现，通过LY294002 抑制PI3K/Akt 信号通过能够明显促进人肾癌786-O 细胞和ACHN 细胞凋亡。本研究发现，经葛根素或LY294002 干预48 h 能够显著提高人肾癌786-O 细胞增殖抑制率和凋亡率，并且葛根素40 mg/L 组效果优于LY294002 15 mg/L 组，提示葛根素具有抑制786-O 细胞增殖并促进其凋亡的作用。

细胞凋亡受阻是癌细胞恶性生长的重要因素，是抗癌新药研究的重要靶点。Bcl-2 家族蛋白（Bcl-2、Bax 等）在细胞凋亡过程中具有关键调控作用，癌细胞恶性快速增殖导致局部缺氧引发氧化应激、Ca2+超载，将病理性刺激Bax 表达上调并诱导其线粒体膜转移，进而使线粒体膜通透性升高，导致具有促凋亡作用的细胞色素C（Cyt C）释放进入细胞质，Cyt C切割活化Caspase-3，并且Caspase-9 也能够剪切活化Caspase-3，Cleaved Caspase-3 参与细胞凋亡的启动与执行[12-13]。Bcl-2 主要于线粒体膜表达，对线粒体膜通透性具有保护作用，并且能够与Bax 形成二聚体而抑制其活性。本研究发现，经葛根素或LY294002干预48 h 能够显著上调人肾癌786-O 细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax 表达并下调Bcl-2表达，显著提高Bax/Bcl-2 比值，葛根素40 mg/L 组对Cleaved Caspase-3、Bax 表达和Bax/Bcl-2 比值的调节作用优于LY294002 15 mg/L 组，这可能是葛根素促进786-O 细胞凋亡的重要机制。

Akt 为PI3K 的下游效应分子，p-PI3K（Tyr317）能够诱导其Ser473 位点磷酸化[p-Akt（Ser473）]而被活化。GSK-3β 是一种多效应功能激酶，能够诱导线粒体Cyt C 释放、激活Caspase-3 而促进细胞凋亡；GSK-3β 为Akt 下游效应分子，p-Akt（Ser473）由细胞膜位移至细胞内而诱导GSK-3β 的Ser21 位点磷酸化[p-GSK-3β（Ser21）]而失去活性，因此，PI3K/Akt/GSK-3β 通路在细胞增殖与凋亡过程中具有重要调控作用[14-15]。此外，既往有研究发现，p-Akt（Ser473）能够诱导Caspase-9 磷酸化失活而间接抑制Caspase-3 活化，并且p-Akt（Ser473）能够抑制Bax 表达[16-17]。本研究发现，经葛根素或LY294002 干预48 h 能够显著下调786-O 细胞p-PI3K（Tyr317）、p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser21）表达，降低p-PI3K（Tyr317）/PI3K、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK-3β（Ser21）/GSK-3β 比值；葛根素40 mg/L 组各指标与LY294002 15 mg/L 组差异无统计学意义。提示葛根素具有抑制人肾癌786-O 细胞PI3K/Akt/GSK3β 信号通路的作用，这可能是其促进786-O 细胞凋亡的重要分子机制。

综上所述，葛根素具有诱导人肾癌786-O 细胞凋亡并抑制其增殖的作用，其机制可能与抑制PI3K/Akt/GSK3β 信号通路有关。本研究为葛根素用于肾癌的防治提供了实验依据，但其作用机制还有待于进一步研究。