黄果梨果酒制备工艺优化

韦唯，叶英，2*，兰丽虹，王红，王树林

（1.青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016；2.青海省青藏高原农产品加工重点实验室，青海 西宁 810016）

黄果梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）为白梨系统的地方梨品种，一般为鹅卵形状，颜色呈金黄色，果皮薄而松软，经自然成熟采摘后-20 ℃冷冻，此过程对色泽影响较小，但目前关于果实其它品质影响的研究鲜见。青海省同仁县是黄果梨的主产地，主要分布在隆务镇、保安镇、年都乎乡等沿隆务河的山水地区。目前，隆务河谷地带黄果梨种植地有297 077 株[1]。由于特殊的地理环境极大地促进了植物光合作用与干物质积累，黄果梨营养价值较高，口感浓郁纯正。黄果梨中含有水分、氨基酸、总糖、总酸、类胡萝卜素等多种营养成分且含量丰富，并含有多种矿物质元素及各种微量元素[2]。此外，黄果梨果实具有独特的保健功能，如清热解毒、化痰利肺。可将其作为天然绿色保健品的优质原材料，因而极具开发潜力[3]。

黄果梨酒是一种由果酒酵母发酵而成的功能性果酒。功能性果酒富含多种营养物质如有机酸及维生素等[4-5]，适量饮用有利于促进血液循环。研究发现李子酒、刺梨酒中含多种生物活性成分且刺梨酒中含有丰富的超氧化物歧化酶[6-7]。陈珍等[8]研究表明刺梨果酒可有效预防高脂诱导小鼠肥胖。李少鹏等[9]研究表明枸杞果酒具有提高机体免疫机能、促进机体健康等功效。青海地区黄果梨资源丰富，但对黄果梨果酒的研究鲜见。因此本文以黄果梨为发酵原料制作果酒，以期为黄果梨资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

黄果梨：青海省同仁县；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（30 000 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；偏重亚硫酸钾（食品级）：山东中天生物科技有限公司；白砂糖：鄄城县永泰糖业有限公司。

1.2 仪器与设备

ESJ110-48 电子天平：上海上平仪器有限公司；BPH9052 电热恒温培养箱、HH-4S 电子恒温不锈钢水浴锅：上海比朗仪器有限公司；酒精计：东莞市科锐仪器科技有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；H/T16MM 台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3 黄果梨果酒制备工艺

1.3.1 工艺流程

原料处理→手动破碎→去核→果胶酶酶解→添加偏重亚硫酸钾→加糖→酵母活化→酒精发酵→过滤→澄清→灭菌装瓶。

1.3.2 操作步骤

1）原料处理：黄果梨从-20 ℃冰箱中取出，15 ℃冷水快速冲洗解冻，剔除霉烂果实，手动破碎去核，打浆。

2）果胶酶酶解：向上述果浆添加0.05%的果胶酶，45 ℃酶解3.5 h。

3）添加偏重亚硫酸钾：将0.013%的偏重亚硫酸钾添加至酶解后的黄果梨果浆中。

4）酵母活化：参考文献[9]的方法，称取一定量酵母于锥形瓶中，添加酵母添加量10 倍糖度为6 的用新制蒸馏水配制的糖水。缓慢搅拌5 min，在35 ℃恒温水浴活化20 min。

5）酒精发酵：在24～32 ℃条件下发酵5～9 d。

6）过滤、灭菌：发酵停止后，将发酵瓶中清酒与底部部分沉淀的酵母、果渣等用纱布分离、过滤处理。对发酵酒液进行巴氏灭菌处理。

7）陈酿：将黄果梨酒液置于4 ℃条件下陈酿30 d，使酒味协调，风味浓郁。

1.4 黄果梨果酒发酵工艺优化单因素试验

1.4.1 发酵温度对黄果梨果酒的影响

固定菌种接种量为0.05%、初始糖添加量为25%、65 ℃灭菌15 min 条件下。调整发酵温度（24、26、28、30、32 ℃）发酵7 d，考察发酵温度对黄果梨果酒的影响。

1.4.2 菌种接种量对黄果梨果酒的影响

固定发酵温度为28 °C、初始糖添加量为25%、65 ℃灭菌15 min 条件下。调整菌种接种量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）发酵7 d，考察菌种接种量对黄果梨果酒的影响。

1.4.3 初始糖添加量对黄果梨果酒的影响

固定菌种接种量为0.05%，发酵温度为28 ℃，在65 ℃灭菌15 min 条件下，调整初始糖添加量（15%、20%、25%、30%、35%）发酵7 d，考察初始糖添加量对黄果梨果酒的影响。

1.4.4 发酵时间对黄果梨果酒的影响

固定菌种接种量为0.05%，发酵温度为28 ℃，初始糖添加量为25%，65 ℃灭菌15 min 条件下，调整发酵时间（5、6、7、8、9 d），考察发酵时间对黄果梨果酒的影响。

1.5 黄果梨果酒发酵工艺优化响应面试验

Box-Behnken 试验设计因素与水平见表1。

表1 响应面因素与水平Table 1 Response surface factors and levels

1.6 黄果梨果酒感官评定及物质成分变化检测

1.6.1 感官评定

选15 名食品专业人员组成一个黄果梨果酒感官评定小组对黄果梨果酒进行评价。感官评价标准见表2。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria

1.6.2 检测方法

总糖含量参照韦璐等[10]的方法，采用蒽酮-硫酸法进行测定；还原糖含量采用直接滴定法进行测定；总酸含量参照杨芳等[11]的方法，采用酸碱滴定法进行测定；多酚含量参考吴晓青等[12]的方法，以没食子酸为标品进行测定；黄酮含量参考李德森等[13]的方法，以芦丁为标品进行测定；VC含量参考刘荣森[14]的方法，以抗坏血酸为标品进行测定；酒精度利用果酒专用酒精计进行测定；糖度利用手持糖度计进行测定。

1.7 数据处理

利用Design-Expert V8.0.6、Microsoft Office Excel 2007 和Origin 2018 软件对试验进行设计与数据分析，每组试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 发酵温度单因素试验结果

发酵温度对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响见图1。

图1 发酵温度对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图1 可知，随着发酵温度的升高，酒精度与感官评分均呈现先上升后下降的趋势。主要原因可能是当发酵温度低于28 ℃时，由于未达最佳发酵条件，导致酵母菌的生长繁殖速率缓慢，黄果梨果酒含糖量过高，口味偏甜，口感较差。当发酵温度高于28 ℃时，酵母发酵迅速，代谢加快导致其容易衰老，使酒精度降低[15]，另黄果梨发酵不完全，果酒缺乏酒香味。综上，选择发酵温度26～30 ℃进行后续响应面试验。

2.2 菌种接种量单因素试验结果

菌种接种量对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响见图2。

图2 菌种接种量对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响Fig.2 Effect of yeast addition on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图2 可知，酒精度与感官评分均呈现先上升后下降的趋势，主要原因可能是当酵母菌接种量小于0.05%时，黄果梨果浆发酵不完全，导致酒精度较低且果酒具有酸味；当菌种接种量大于0.05%时，黄果梨果浆发酵迅速，短时内发酵体系中酒精含量急速增加，在此情况下因酒精含量超过酵母的耐受能力导致部分酵母发生衰老和死亡[16]。果酒也会因此而具有酵母味，使感官评分降低。综上，选择菌种接种量0.04%～0.06%进行后续响应面试验。

2.3 初始糖添加量单因素试验结果

初始糖添加量对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响见图3。

图3 初始糖添加量对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响Fig.3 Effect of initial sugar addition on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图3 可知，糖作为酒精发酵所需的营养物质对整个发酵过程有重要的影响。当初始糖添加量为15%、20%时，果酒口感酸涩。并且酒精度与感官评分相对较低，这主要是因为发酵体系中缺乏糖类营养物质。初始糖添加量为25%时果酒的酒精度为12.7% vol，感官评分为88.85，果酒香味浓郁。当初始糖添加量超过25%时，酒味刺鼻掩盖了黄果梨的清香。综上得知，选择初始糖添加量20%～30%进行后续响应面试验。

2.4 发酵时间单因素试验结果

发酵时间对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响见图4。

图4 发酵时间对黄果梨果酒酒精度及感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory scores of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图4 可知，当发酵时间为5～6 d 时，发酵体系中总糖含量较低，致使酒精度与香气成分积累不足，果酒在酒精度与感官评分方面略有不足；当发酵时间过长为8～9 d 时，酒精含量虽能达到最大程度积累但酵母菌生长代谢受阻，此时会代谢产生各种不良产物且出现轻微的酸败现象，进而影响酒体口感，致使感官评分大大降低。因此选择7 d 为黄果梨果酒最佳的发酵时间。

2.5 响应面试验结果及方差分析

黄果梨果酒发酵响应面试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 响应面试验结果与分析Table 3 Response surface test results and analysis

表4 响应面试验方差分析结果Table 4 Variance analysis result of response surface test

黄果梨果酒酿造工艺参数的回归方程为Y=89.90-1.50A-1.12B+1.88C+1.25AB+1.75AC-2.00BC-2.65A2-6.90B2-5.90C2。

由表4 可知，该模型适合黄果梨果酒酿造工艺试验的预测。通过显著性检验可知，除了B、AB、AC 对感官评分显著（P＜0.05），BC 不显著，其余均为极显著。对黄果梨果酒感官评分影响强弱的顺序为初始糖添加量＞发酵温度＞菌种接种量。

2.6 交互作用分析

各因素交互作用的响应面与等高线见图5。

图5 两因素交互作用的响应面及等高线Fig.5 Response surfaces and contour lines of interaction between each two factors

由图5 可知，AB、AC 等高线趋于椭圆，表明交互作用明显[17]，对黄果梨果酒感官评分影响较大；而BC交互作用不明显，对黄果梨果酒感官评分影响较小。

2.7 营养及功能成分变化检测结果

2.7.1 发酵过程中总糖含量变化

总糖含量在黄果梨果酒的口感风味、色泽和稳定性方面有着重要作用[18]。黄果梨果酒中总糖含量的变化如图6 所示。

图6 黄果梨果酒发酵过程中总糖含量变化Fig.6 Changes of total sugar content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图6 可知，随着发酵时间的延长，1～5 d 总糖含量急速下降，主要原因是初期发酵液营养丰富，酵母活力旺盛，在此条件下快速消耗总糖用于酵母自身生长繁殖以及代谢产生酒精；而从第7 天开始总糖降低速率减缓，主要是由于酒精度升高，酵母老化、发酵环境发生改变。发酵7 d 时黄果梨果酒总糖含量为28 g/L，属半甜型果酒。结合单因素及响应面结果可知总糖含量对黄果梨果酒的酒精度与感官评分有着重要的影响。

2.7.2 发酵过程中还原糖含量变化

黄果梨果酒中还原糖含量的变化如图7 所示。

图7 黄果梨果酒发酵过程中还原糖含量变化Fig.7 Changes of reducing sugar content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图7 可知，随着发酵时间的延长，还原糖含量在发酵过程中呈现先上升后下降的趋势。0～1 d 内上升的原因主要是白砂糖在酵母中相应酶的作用下分解产生还原糖；3～5 d 内急速下降，主要原因是酵母活力旺盛，整个发酵体系处于主发酵期；5～9 d 内下降趋势减缓，主要原因可能是发酵体系中缺乏发酵底物，且因发酵过程中产生大量的代谢产物，酵母代谢受抑制，分解糖分能力大大下降。

2.7.3 发酵过程中酒精度、糖度变化

黄果梨果酒中酒精度、糖度的变化如图8 所示。

图8 黄果梨果酒发酵过程中酒精度、糖度变化Fig.8 Changes of alcohol content and sugar during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图8 可知，在整个发酵过程中，酒精度与糖度整体表现出相反的变化趋势。黄果梨原料糖度为12 °Bx，通过添加白砂糖使发酵液初始糖度为30 °Bx。发酵0～1 d 时因酵母需要适应发酵环境，所以酒精度基本不变。发酵第1～3 天时，发酵液中的糖类被酵母用于自身生长繁殖及无氧发酵，酒精度快速增加，糖度持续降低。3～7 d 发酵过程中酒精度平稳上升，此过程也是各种活性成分积累的最佳时间；从第7 天开始酒精度逐渐趋于平缓并达到最大值13.8% vol，糖度则为21.23 °Bx，这主要与酵母的生长代谢受阻有关。发酵体系中糖类被消耗，无法提供充足的营养物质，且此时发酵液的pH 值以及发酵液中过高的酒精度都会对酵母的生长带来不利影响，导致后期酒精度增加缓慢甚至趋于降低。

2.7.4 发酵过程中VC含量变化

黄果梨果酒中VC含量的变化如图9 所示。

图9 黄果梨果酒发酵过程中VC 含量变化Fig.9 Changes of VC content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图9 可知，在整个发酵过程中，VC含量总体呈现先下降后上升的趋势。主要原因可能是由于酵母细胞在发酵初期进行有氧呼吸，生长繁殖而产热，致使整个发酵体系温度较高，导致VC分解[19]。在第7 天时上升至8.436 g/L，VC含量基本达到最大值。

2.7.5 发酵过程中黄酮、多酚含量变化

黄果梨果酒中黄酮、多酚含量的变化如图10 所示。

图10 黄果梨果酒发酵过程中黄酮、多酚含量变化Fig.10 Changes of flavone and polyphenol contents during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图10 可知，在整个发酵过程中，黄酮、多酚含量变化趋势基本一致，均先上升后下降。主要原因是发酵前期，随着黄果梨果酒中酒精含量的不断积累，导致黄酮和多酚的浸提量不断增加，在5 d 时均达到最大值，分别为0.943 5、6.669 mg/L；发酵后期，黄酮、多酚含量明显降低，分析原因可能是多酚类物质因贮藏温度、含氧量及果实成分等外界因素的改变而分解[20]。但相比最初值含量都明显增加，说明发酵有利于黄酮、多酚等活性成分的保留。

2.7.6 发酵过程中总酸含量变化

总酸含量与黄果梨果酒的感官品质密切相关[21]。黄果梨果酒中总酸含量的变化如图11 所示。

图11 黄果梨果酒发酵过程中总酸含量变化Fig.11 Changes of total acid content during fermentation of Pyrus bretschneideri Rehd.fruit wine

由图11 可知，在整个发酵过程中，总酸含量呈现逐步上升的趋势。主要原因是黄果梨本身酸性成分含量较高，且在发酵过程中酵母细胞自身代谢产酸，以及因外界高糖环境激发的细胞代谢产酸的应激效应所产生的酸[22]。在整个发酵过程中应密切关注其含量变化以更好控制黄果梨果酒的感官品质。

3 结论

本研究以响应面法优化黄果梨果酒的制备工艺，并通过测定发酵过程中总糖、还原糖、酒精度、糖度、VC、黄酮、多酚、总酸含量等，对黄果梨果酒品质进行评价。得到最佳发酵工艺条件：发酵温度28 ℃、初始糖添加量25%、菌种接种量0.05%、发酵时间7 d。此条件下制得的黄果梨果酒感官评分达92，酒精度达13% vol。酒体澄清，有光泽。黄果梨果酒发酵过程中，随着发酵时间的延长及酒精度的增大，半甜型黄果梨果酒总糖、还原糖、糖度等最终含量均降低。黄酮、多酚含量呈现先上升后缓慢下降的变化趋势，总酸含量整体上升。VC含量相比发酵第1 天增加4.345 g/L。综上可知，活性物质成分的积累与酒精含量变化有着密不可分的关联。可以通过严格把控发酵条件，密切关注酒精含量变化，达到各种营养及功能物质富集的目的。本试验为黄果梨果酒的酿造工艺提供科学依据。