hsa_circ_0006404、miR-151-3p在胰腺癌组织中表达及其临床诊断价值

贾振飞 王嘉毅 李少华

作者单位：455000 河南省安阳市人民医院

胰腺癌是各种癌症中预后最差的一种,其5年总生存率仅为9%[1]。由于胰腺癌高度侵袭性特征和缺乏早期典型症状,导致多数患者确诊时已处于晚期,甚至发现远处转移,仅20%的患者可以行手术切除,但术后仍需面临较高的复发风险[2]。据报道,当肿瘤小于1 cm时,其5年生存率可达到100%[3]。因此,胰腺癌的筛查、早期诊断对于改善预后至关重要。环状RNA(circRNA)是一类主要由前体mRNA反向剪接形成的内源性非编码RNA,在胰腺癌诊断、发展、耐药性中有重要意义[4]。hsa_circ_0006404又称为circFOXO3,是circRNA中重要一员,与细胞分化、凋亡和细胞周期进程有关,其在癌症发展中的调控作用复杂且关键[5]。例如,circFOXO3在食管鳞状细胞癌组织中下调表达,过表达circFOXO3能够抑制肿瘤细胞生长、迁移和侵袭[6]。微小RNA(miRNA)稳定存在于血清中,为生物标志物检测提供了一种易于获取和无创来源。既往研究表明,miRNA的异常表达与胰腺癌细胞增殖、侵袭和转移有关[7]。其中miR-151-3p已证实参与乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种癌症过程[8]。然而,circFOXO3、miR-151-3p在胰腺癌中的表达与临床病理特征及对胰腺癌的诊断效能尚不清楚。本研究通过检测胰腺癌癌组织及血清中circFOXO3、miR-151-3p表达变化,分析癌组织circFOXO3、miR-151-3p表达与临床病理特征的关系,以及血清circFOXO3、miR-151-3p诊断胰腺癌的效能。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019年1月至2021年12月在本院行手术治疗的100例胰腺癌患者为PC组,其中年龄40～75岁,≥60岁47例,<60岁53例,男、女分别为58、42例,TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期63例,Ⅲ期37例;胰头患者79例,胰体尾者21例。对照组为同期在本院健康体检的90例志愿者,年龄40～72岁(≥60岁患者40例,<60岁患者50例),男、女分别为48、42例。PC组与对照组年龄分布(t=1.161,P=0.247)、性别(χ2=0.418,P=0.518)比例无显著差异(P>0.05)。纳入标准:①原发性胰腺癌,可行手术切除;②术前未进行免疫治疗,放、化疗;③术前经胰腺穿刺活检、临床检查、影像学检查确诊;④术后肿瘤组织经本院专业医师检测确诊为胰腺癌。排除标准:①合并非胰腺癌恶性肿瘤;②合并肝硬化、肝炎、急性感染;③近期糖皮质激素服用史;④胰腺囊肿患者。

1.2 标本收集

血清标本收集:对照组90例志愿者于体检时、100例胰腺癌患者于手术前采集空腹外周血,离心后取血清,-80 ℃贮存备用。

组织标本收集:手术期间收集胰腺癌患者切除的癌组织、癌旁组织(距癌灶边缘>3 cm),编号后立即速冻于液氮中,随后贮存在-80 ℃统一检测。

1.3 circFOXO3、miR-151-3p表达水平的检测

qRT-PCR技术检测癌组织及血清中circFOXO3、miR-151-3p表达水平。使用TRIzol试剂从癌组织、癌旁组织以及血清中提取总RNA,通过微量核酸蛋白分析仪检测RNA纯度和浓度;使用cDNA合成试剂盒(东洋纺,上海)得到cDNA,按照 SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara,日本)配制成10 μL反应体系,然后在CFX96 Real-Time System(Bio-Rad,美国)上通过实时PCR测定circFOXO3、miR-151-3p的表达,反应程序为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s,39个循环。引物序列见表1,所有引物均由金唯智生物公司合成。circFOXO3以GADPH为内参,miR-151-3p以U6为内参,使用2-△△Ct法计算表达水平。

表1 引物序列

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组织中circFOXO3、miR-151-3p表达水平比较

与癌旁组织相比,癌组织中circFOXO3表达水平降低,miR-151-3p表达水平升高(P<0.05),见表2。

表2 组织中circFOXO3、miR-151-3p表达水平比较

2.2 circFOXO3、miR-151-3p表达与胰腺癌临床病理特征的关系

低分化、Ⅲ期、淋巴结转移的胰腺癌患者癌组织中circFOXO3表达水平低于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移者,而miR-151-3p表达水平则高于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移者(P<0.05),见表3。

表3 circFOXO3、miR-151-3p表达与胰腺癌临床病理特征的关系

2.3 血清circFOXO3、miR-151-3p表达水平比较

PC组与对照组血清circFOXO3、miR-151-3p表达水平比较差异显著(P<0.05)。PC组circFOXO3表达水平显著低于对照组,miR-151-3p表达水平显著高于对照组(P<0.05),见表4。

表4 两组血清circFOXO3、miR-151-3p表达水平比较

2.4 circFOXO3与miR-151-3p表达的相关性分析

采用ENCORI在线软件预测结果显示,circFOXO3与miR-151-3p存在结合位点(图1)。相关性分析结果显示,血清中circFOXO3与miR-151-3p存在负相关性(γ=-0.619,P=0.000);癌组织中circFOXO3与miR-151-3p同样存在负相关性(γ=-0.610,P=0.000)。见图2、3。

图1 circFOXO3序列中含有与miR-151-3p互补的核苷酸序列

图2 血清circFOXO3与miR-151-3p的相关性分析

图3 癌组织中circFOXO3与miR-151-3p的相关性分析

2.5 血清circFOXO3、miR-151-3p诊断胰腺癌的ROC曲线

ROC结果显示,circFOXO3诊断的胰腺癌曲线下面积为0.879(95%CI:0.829～0.928),最佳截断值为0.87。miR-151-3p诊断胰腺癌的曲线下面积为0.937(95%CI:0.904～0.971),截断值为1.24。circFOXO3联合miR-151-3p诊断的曲线下面积为0.968(95%CI:0.945～0.992),见图4。

图4 血清circFOXO3、miR-151-3p诊断胰腺癌的ROC曲线

2.6 血清circFOXO3、miR-151-3p诊断胰腺癌的效能

血清circFOXO3诊断胰腺癌的截断值为0.87,低于0.87判定为阳性,高于0.87则为阴性;circFOXO3诊断胰腺癌的灵敏度为83.00%,准确率为83.16%,特异度为83.33%。miR-151-3p诊断胰腺癌的截断值为1.24,高于1.24判定为阳性,否则为阴性;miR-151-3p诊断胰腺癌的特异度为87.78%,准确率为87.37%,灵敏度为87.00%。circFOXO3联合miR-151-3p诊断的特异度为91.11%,灵敏度为90.00%,准确率为90.53%,具体结果见表5。

表5 血清circFOXO3、miR-151-3p诊断胰腺癌的效能

3 讨论

胰腺癌是一种高致死率的胃肠道癌症,早期症状较隐匿,难以发现,5年生存率低[9]。《2020年全球癌症统计》显示,仅在2020年全球共有胰腺癌新病例495773例,相关死亡病例为466003例,其死亡率与发病率几乎一致[10]。预计到2050年,全球胰腺癌的发病率将增加到每10万人中18.6例,年均增长1.1%[9]。胰腺癌的确切病因尚不清楚,但许多因素与该病发展有关,包括年龄、性别、ABO血型、微生物群、饮食因素、种族、胰腺炎、糖尿病家族史、慢性胰腺炎、胰腺囊性病变、遗传易感性、吸烟、饮酒等[11]。目前,手术仍然是治愈胰腺癌的唯一方法,然而多数患者由于早期无症状,在确诊时已错过最佳手术切除时机,即便手术成功,仍要面临局部转移或复发风险[12]。因此,急需筛选用于早期胰腺癌诊断的分子标志物。

circRNA源于前体信使RNA(mRNA)的反向剪接,具有稳定的共价环状结构,能抵抗RNase R的消化,并具有独立于宿主基因的功能[13]。研究发现circRNA(hsa_circ_0000069、hsa_circ_0006117、hsa_circ_0007334)在胰腺癌组织中异常表达,参与胰腺癌的发生和转移[14]。例如,hsa_circ_0006117在胰腺癌组织和细胞系中呈高表达,并通过调节miR-96-5p/KRAS/MAPK促进胰腺癌的进展[13]。既往研究显示,circFOXO3在非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、卵巢癌、膀胱癌等恶性肿瘤中异常下调表达,低表达circFOXO3者预后较差[15]。膀胱癌组织中circFOXO3呈下调表达,过表达circFOXO3后能够抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭[16]。Zhang等[17]发现,circFOXO3通过海绵化miR-155和激活非小细胞肺癌细胞中的FOXO3基因表达,抑制癌细胞增殖和侵袭,并认为circFOXO3是非小细胞肺癌中的肿瘤抑制因子。本研究显示,癌组织中circFOXO3表达水平较癌旁组织显著降低,血清circFOXO3表达水平明显低于对照组,提示circFOXO3的异常低表达参与胰腺癌发生、发展。张辉等[18]有关胃癌的研究显示,circFOXO3的异常表达与浸润深度、TNM分期、组织分化有关。circFOXO3与胰腺癌临床病理特征的关系尚未明确。本研究中Ⅲ期胰腺癌患者癌组织circFOXO3表达水平较Ⅰ+Ⅱ期患者显著降低,低分化、淋巴结转移的胰腺癌患者中circFOXO3表达水平减少,提示circFOXO3不仅在胰腺癌中呈现低表达,且参与了胰腺癌的发展进程,与患者部分病理特征有关,其低表达可促进胰腺癌恶化。本研究采用ROC曲线分析血清circFOXO3表达水平诊断胰腺癌的效能,结果显示最佳截断值为0.87,曲线下面积为0.879(95%CI:0.829～0.928)。将低于0.87判定为阳性,结果发现circFOXO3诊断胰腺癌的灵敏度为83.00%,准确率为83.16%,特异度为83.33%。鉴于circFOXO3较高的检测效能,且与胰腺癌进展有关,其有作为胰腺癌诊断的血清标志物的潜能,可以辅助临床早期诊断胰腺癌。

miRNA能够在血液、唾液、尿液、腹腔液等体液或组织中检测到,并被认为是潜在的癌症生物标志物[19]。血清mir-25已被提议作为胰腺癌的诊断生物标志物,而mir-25联合CA19-9检测Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌的敏感性为97.50%,特异性为90.11%[11]。其中miR-151-3p作为miRNA中的一员,已被证实能够调节多种与肿瘤进展相关的信号通路,影响肿瘤进展[20]。近期有关胰腺癌的研究显示,胰腺癌细胞中mir-151a-3p表达水平升高,下调mir-151a-3p表达水平会抑制癌细胞侵袭、增殖及迁移[21]。同时过表达mir-151a-3p能够抑制胰腺癌细胞凋亡,但促进细胞侵袭、增殖[22]。本研究结果显示,癌组织和血清中miR-151-3p表达水平升高,与既往研究一致,提示胰腺癌中miR-151-3p的异常表达可能参与胰腺癌发生、发展,其可能成为一种新的血清学指标用于诊断胰腺癌。另有研究显示,miR-151-3p在鼻咽癌中表达水平升高与淋巴结转移、分化程度低、临床分期高及远处转移相关[23]。然而,miR-151-3p的异常表达与肿瘤临床病理特征的关系尚未有报道。本研究发现,Ⅲ期胰腺癌患者癌组织中miR-151-3p表达水平较Ⅰ+Ⅱ期高,且miR-151-3p在淋巴结转移和低分化的胰腺癌患者中均显著增加,提示miR-151-3p可能在肿瘤细胞的增殖和迁移中起着重要作用,其高表达对胰腺癌进展有促进作用。本研究结果显示,miR-151-3p诊断胰腺癌的曲线下面积为0.937(95%CI:0.904～0.971),最佳截断值为1.24,高于1.24的患者判定为胰腺癌,结果发现miR-151-3p诊断特异度为87.78%,准确率为87.37%,灵敏度为87.00%,说明miR-151-3p诊断胰腺癌的效能较好。circFOXO3联合miR-151-3p诊断的曲线下面积为0.968(95%CI:0.945～0.992),灵敏度为90.00%,准确率为90.53%,特异度为91.11%,优于circFOXO3或miR-151-3p单独检测效能。提示circFOXO3联合miR-151-3p检测可以弥补单一指标检测对胰腺癌的诊断不足之处,防止出现漏诊现象,提高胰腺癌的诊断准确性及检出率。

CircRNA具有互补的miRNAs结合位点,可以竞争性结合miRNAs以抑制其功能。本研究通过生物信息学分析发现,circFOXO3与miR-151-3p存在结合位点;进一步采用Pearson法分析示,癌组织及血清circFOXO3与miR-151-3p均存在负相关性,提示二者在胰腺癌中可能存在某种调控作用,这也是我们后续探究方向。

综上所述,胰腺癌中circFOXO3表达水平降低,miR-151-3p表达水平升高,癌组织circFOXO3、miR-151-3p表达与部分临床病理特征有关,血清circFOXO3联合miR-151-3p诊断胰腺癌的效能较佳。然而,本研究纳入样本量较小,所得结果有待后续扩大样本进行验证。