LDCT、肿瘤相关自身抗体、TFPI-2基因甲基化联合检测对肺癌的早期诊断价值

石俊英 王 慧 张斯佳 李 铭

近些年,肺癌的发病率正逐年升高,其具有较高的致死率和发病率,严重威胁人们的生命安全[1]。但由于早期肺癌并无特异性症状,直至确诊已进展至中晚期[2]。CT检查已被逐步运用多种癌症的早期检查中,可有效观察病灶的情况,但常规CT的辐射较大,具有局限性,因此低剂量CT(Low dose CT,LDCT)已被逐步运用在早期肺癌的诊断当中,尤其是针对于肺部小结节的诊断率更高,但也存在假阳性率较高的特点[3]。已有研究发现,肿瘤的发生和发展途中所生成的相关抗原,均会被免疫系统识别,随后会生成相关抗体[4]。P5、RNA解螺旋酶自身抗体4-5(RNA helicase autoantibody 4-5,GBU4-5)、黑色素瘤抗原A1(Melanoma antigen A1,MAGE A1)、肿瘤相关基因(Tumor related genes,CAGE)、性别决定基因家族2(Sex determining gene family 2,SOX2)、蛋白基因产物9.5(Protein gene product 9.5,PGP9.5)、G抗原7(G antigen 7,GAGE7)均是肿瘤相关自身抗体的一种,已在多种肿瘤的早期诊断运用[5]。组织因子途径抑制物-2(Tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)是抑癌基因的一种,与肿瘤的发生存在一定关系,且其甲基化成都也随着肿瘤的分期和升高[6]。但目前其与LDCT以及肿瘤相关自身抗体的联合检测运用仍较少,因此本研究为此展开讨论,旨在研究LDCT、肿瘤相关自身抗体以及TFPI-2甲基化联合检测诊断早期肺癌的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院 2019年5月至2021年5月收治的109疑似早期肺癌患者作为研究对象,其中男性69例,女性40例,年龄49～63岁,平均年龄(55.17±2.57)岁。纳入标准:①患者疑似肺癌诊断标准;②患者术后经病理学检查符合早期肺癌诊断标准;③患者无其他系统恶性肿瘤;④患者于我院首次接受治疗;排除标准:①患者存在LDCT检查禁忌症;②患者年龄>80岁;③患者神经意志不正常;④患者临床资料不完整。

1.2 研究方法

金标准:以手术病理结果作为金标准,术后结果发现109例疑似早期肺患者中阳性101例,阴性8例,鳞癌19例,腺癌79例,小细胞癌11例。

LDCT检查方法:由我院医学影像科进行检查,采用SIEMENS Defintiion 64层CT检查设备,检查前需要将患者身上佩戴的金属物品全部去除。采用特制衣物遮挡非监测部位后,嘱咐患者进行呼吸,在深吸气后闭气。对患者的肋膈角到肺尖进行扫描,持续10 s左右。其中扫描参数:管电流50 mA,电压120 kV,层厚1.0 mm,层距1.0 mm,重建层厚1.0 mm。最终图像由两名主治医师资历以上医师完成阅片,如遇到意见不合需要沟通交流最后完成阅片。

肿瘤相关自身抗体检测:所有患者均于入院后首日抽取清晨空腹静脉血5 mL,以美国贝克曼库尔特医疗有限公司的Microfuge 16台式微量离心机进行离心,3500 r/min,高速离心10 min,获得上清液并在6 h内完成检查。SOX2和MAGE A1选取上海研启生物科技有限公司的检测试剂盒进行检测;PGP9.5和P5选取北京生研生物技术有限公司的检测试剂盒进行检测;GAGE7、GBU4-5和CAGE选取上海心语生物科技有限公司的检测试剂盒进行检测,以上均采用酶联免疫吸附试验法进行检测。BK-EL10A酶标仪购自山东欧莱博医疗器械有限公司。其中P53<13.1 kU L、MAGE A1<11.9 kU/L、CAGE<7.2 kU/L 、SOX2<10.3 kU/L、PGP9.5<11.1 kU/L、GAGE7<7.2 kU/L、GBU4-5<17.0 kU/L,以上任何一项大于正常范围即为阳性,七种抗原中任何1项诊断为阳性即为联合诊断阳性。

TFPI-2基因甲基化:DNA提取试剂盒与PCR扩增试剂盒均购自全式金生物技术有限公司,EZDNA甲基化修饰试剂盒购自ZYMO公司,CpG甲基转移酶购自NEB公司,引物购自Invitrogen公司。按照说明书进行DNA提取,运用甲基化特异性引物和非特异性引物PRC扩增完成修饰的DNA。TFPI-2甲基化引物为5'-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3',5'-ACGACCCG-CTAAACAAAACG-3',扩增产物为95bp,TFPI-2非甲基化引物为5'-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3',5'-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3',扩增产无语为89bp,以试剂盒进行PCR反应体系的设计,甲基化的退火温度为54 ℃,非甲基化退火温度为60 ℃,同时设置被甲基转移酶SssI修饰的正常组织为阳性组、没有被甲基转移酶SssI修饰的正常组织为阴性组,最后通过10 μL的PCR扩增产物完成凝胶电泳,并对结果进行判定。

1.3 临床指标

所有患者均接受LDCT检查,以术后病理学检查作为金标准,分析LDCT检出率以及阳性患者和阴性患者肿瘤相关自身抗体、TFPI-2基因甲基化阳性率,分析LDCT联合SOX2、PGP9.5、GAGE7和TFPI-2基因甲基化对于早期肺癌的诊断价值。

1.4 方法

2 结果

2.1 LDCT对早期肺癌的检出率分析

109例疑似肺癌患者经过病理学检查确诊101例,LDCT诊断肺癌阳性85例,检出率为84.15%,见表1。

表1 LDCT对早期肺癌的检出率分析/例

2.2 阳性患者与阴性患者肿瘤相关自身抗体水平对比

与阴性组患者相比,阴性组患者肿瘤相关自身抗体P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5、GAGE7和GBU4-5水平显著更高,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 阳性患者与阴性患者肿瘤相关自身抗体水平对比

2.3 阳性患者和阴性患者TFPI-2基因甲基化阳性率对比

与阴性组患者TFPI-2基因甲基化阳性率[12.50%(1/8)]相比,阳性组患者[48.51%(49/101)]显著更高,差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 阳性患者和阴性患者TFPI-2基因甲基化阳性率对比(例,%)

2.4 LDCT、肿瘤相关自身抗体联合TFPI-2基因甲基化对早期肺癌的诊断价值

经过ROC曲线分析结果发现,LDCT+P53+MAGEA1+GAGE+SOX2+PGP9.5+GAGE7+GBU4-5联合TFPI-2基因甲基化对于早期肺癌的诊断灵敏度和特异度均高于任意单一指标(P<0.05),见表4,图1。

图1 LDCT、肿瘤相关自身抗体联合TFPI-2基因甲基化对于早期肺癌的诊断价值ROC曲线图

表4 LDCT、肿瘤相关自身抗体联合TFPI-2基因甲基化对早期肺癌的诊断价值

3 讨论

肺癌现如今已是恶性肿瘤致死率最高的癌症,其5年生存率仅有12%左右,对于肺癌的早期诊断意义较高[7]。目前肺癌的金标准仍然是术后病理学检查,但是由于属于有创操作,具有创伤性[8]。因此寻找更加有效的早期肺癌诊断方式是近些年的研究重点。

CT检查是近些年常用的癌症检查手段,可清晰的检查组织结构,并从多个角度进行显示,同时也能够重组层厚,重建重点区域部分,使得医师能够从多个维度进行观察[9]。但是常规CT辐射性较高,有一定几率使良性病变恶化,局限性较高。LDCT以低剂量进行扫描,不仅能够保留CT的敏感度,还能降低剂量,降低不良反应的发生[10]。本研究结果显示,LDCT诊断肺癌阳性85例,检出率为84.15%。可见,虽然降低了剂量的使用,但并不会使检出率降低。肿瘤的发生途中会生成少量异常蛋白,这被称之为肿瘤相关性抗原[11]。这一类抗原在突变、过表达、异常表达、折叠错误等方式得到免疫源性,进而生成所对应的抗体。P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5和GAGE7是自身抗体的抗体谱。有研究发现,该6种自身抗体的检测诊断早期肺癌阳性率较高[12]。据陈婕等[13]研究发现,CAGE,GAGE7,GBU4-5,MAGE A1,P53,PGP9.5,SOX2自身抗体联合检测明显优于肿瘤标志物的检测。本研究结果显示,与阴性组患者相比,阴性组患者肿瘤相关自身抗体P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5、GAGE7和GBU4-5水平显著更高。这提示,肿瘤相关自身抗体P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5、GAGE7和GBU4-5在早期肺癌的发生中起到关键作用。原癌基因高表达以及抑癌基因低表达是癌症发生的重要途径。抑癌基因的和基因突变有关,同时和表观遗传修饰也有一定的关系[14]。DNA甲基化则是表观遗传的主要方式,在肿瘤的初期即可出现。TFPI-2的蛋白酶抑制剂的一种,可抑制肿瘤生长以及转移,是潜在的抑癌基因[15]。TFPI-2基因启动启动子CpG岛高度甲基化是引起其水平在恶性肿瘤中水平降低的主要机制[16]。本研究结果显示,与阴性组患者TFPI-2基因甲基化阳性率相比,阳性组患者显著更高,展开ROC分析发现其对于早期肺癌具有较高的敏感度。提示TFPI-2基因甲基化是一种重要的肺癌标志物,其检测有利于早期肺癌的诊断。本研究进一步将LDCT、肿瘤相关自身抗原和TFPI-2基因甲基化联合检测发现,其了灵敏度和特异性均高于各项单独检测,临床运用价值较高,值得推广和运用。但本次研究选取的是早期肺癌患者,并且大多数患者均为腺癌,鳞癌和小细胞肺癌选取较少,可能会使实验存在一定偏差,因此以后应当扩大样本量进一步进行研究。

综上所述,LDCT、7种肿瘤相关自身抗原联合TFPI-2基因甲基化联合检测可提高对于早期肺癌的诊断价值,运用效果较高,灵敏度和特异性明显高于各项单独检测。