南极磷虾不同部位的脂质特性

王 茜, 刘 富 俊, 王 鑫 淼, 阴 法 文,3,4, 周 大 勇,3,4

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034;2.辽渔集团有限公司, 辽宁 大连 116000;3.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心, 辽宁 大连 116034;4.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

南极磷虾(Euphausiasuperba),又名大磷虾或南极大磷虾。南极磷虾含有大量优质蛋白,占干重的60%～65%[1],具有很高的开发和利用价值[2]。南极磷虾油主要由甘油酯、磷脂、游离脂肪酸、甾醇及虾青素等组成[3]。其中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量也十分丰富[4],具有如抑制肝脂肪化、抗过敏、抗氧化、降血脂、降血糖及心脏保护等多种生物学功能[5-6]。近年来,南极磷虾油作为一种新型的海洋功能性油脂受到广泛的关注。

本实验以南极磷虾全虾、虾肉和虾壳为研究对象,分析脂质含量、脂质组成、脂肪酸组成等,并分析磷脂分子种信息,对比南极磷虾不同部位的脂质特性,以期为南极磷虾源磷脂类精准营养食品开发的原料选择提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻南极磷虾,辽渔集团有限公司。

磷脂标准品(GPCho 12：0/12：0和GPEtn 12：0/12：0),Avanti公司。

1.2 仪器与设备

LG-1.0真空冷冻干燥机,沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司;4000 QTRAP质谱仪,AB Sciex公司;LC-20AD高效液相色谱仪,日本岛津公司;Agilent 5973质谱仪,美国Agilent公司;Agilent 6890N气相色谱仪,美国Agilent公司;MK-6S棒状薄层色谱分析仪,雅特隆公司。

1.3 方 法

1.3.1 脂质提取

采用改良Folch法提取原料中的总脂质[7]。具体步骤：将1 g磷虾原料(全磷虾粉、磷虾肉粉或磷虾壳粉)与1 mL去离子水完全混合,加入3.25 mL体积比2∶1的氯仿-甲醇混合溶剂。充分振荡混合后,加入1.25 mL氯仿。再次充分振荡混合后,将混合物于7 800g、4 ℃离心10 min。收集有机层并于35 ℃下旋转真空蒸发,除去有机溶剂,制备不同原料来源的南极磷虾脂质。

1.3.2 脂质含量计算

w=m0/m

式中：m0为脂质质量;m为原料质量。

1.3.3 脂肪酸组成分析

利用气质联用仪检测南极磷虾脂质样品的脂肪酸组成：HP-5-MS毛细管柱,30 m×0.25 m×0.25 μm;EI源,70 eV;载气为氦气,48.95 kPa;气体体积比50∶1;溶剂延迟4 min。根据GC-MS中各组分保留时间以及质谱图,对比脂肪酸标准品,并在NIST02库检索鉴定,通过峰面积归一法对各脂肪酸进行定量分析。

1.3.4 脂质组成分析

利用棒状薄层色谱-氢火焰离子检测器(MK-6S)检测南极磷虾脂质样品的脂质组成及相对质量分数。检测参数：扫描速度30 s/根;空气体积流量2 L/min;氢气体积流量160 mL/min。对所得谱图各脂质成分的峰进行积分,采用峰面积归一化法计算得到各类脂质成分的相对质量分数。

1.3.5 磷脂分子种分析

利用高效液相色谱-质谱仪定性、定量检测南极磷虾脂质的甘油磷脂分子种。

1.3.5.1 液相色谱条件

色谱柱,Ascentis Express HILIC柱(15 cm×2.1 mm×2.7 μm);流动相A,体积比95∶2.5∶2.5的乙腈-水-甲酸铵溶液(100 mmol/L,pH 3.2);流动相B,体积比2.5∶97.5的甲酸铵-水溶液(100 mmol/L,pH 3.2);体积流量,0.2 mL/min;洗脱梯度条件：0～20 min,0～20% B;20～21 min,20%～50% B;21～31 min,50% B。

1.3.5.2 质谱条件

离子源为ESI源,雾化气压力0.172 MPa,涡轮气压力207 MPa,离子源温度425 ℃,扫描范围m/z350～1 000。

一级质谱扫描在正离子模式下进行,喷雾电压5 500 V,磷脂酰胆碱(glycerophosphocholine,GPCho)采用母离子扫描(+PIS),扫描质荷比为184的带电碎片,即磷酸酯化的胆碱;磷脂酰乙醇胺(glycerophosphoethanolamine,GPEtn)采用中性丢失扫描(+NLS),扫描质荷比为141的中性丢失碎片,即磷酸化的乙醇胺。

二级质谱扫描在负离子模式下进行,喷雾电压-4 500 V,采用增强子离子扫描模式(-EPI),可以采集所有磷脂的二级质谱信息,以进一步推导磷脂的准确结构。

对南极磷虾脂质进行GPCho和GPEtn的磷脂分子种半定量分析,样品质量浓度均为100 μg/mL,加入内标分别为GPCho 12：0/12：0(0.35 μg/mL)和GPEtn 12：0/12：0(0.45 μg/mL);进样量分别为5和10 μL。

1.3.6 统计学分析

所有检测重复3次,结果以(平均值±标准差)表示。采用SPSS 19.0软件进行统计分析,采用ANOVA分析和Student-Newman-Keuls(SNK)检验进行统计学分析。结果标注不同英文字母表示存在显著性差异(p<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 脂质含量

采用Folch法提取南极磷虾脂质,测得南极磷虾的全虾、虾肉和虾壳的脂质质量分数分别为(14.35±0.06)%、(7.96±0.12)%和(15.52±0.54)%。可见,南极磷虾不同部位脂质质量分数差异较大,虾壳中的最高。麦康森等[8]采用索氏抽提法测定了南极磷虾不同部位的脂质质量分数,其中磷虾全虾和磷虾肉中的脂质质量分数分别为12.10%和5.17%。研究结果与本研究的实验结果基本一致。

2.2 脂肪酸组成

由表1可以看出,南极磷虾脂质中脂肪酸主要包括C14：0、C16：0、C18：1n-9、C18：1n-5、C20：5n-3(EPA)和C22：6n-3(DHA)。全虾、虾肉和虾壳PUFA的含量较高,其中以EPA和DHA为主,与薛梅等[9]的研究结果一致。可见,南极磷虾中含有丰富的EPA和DHA。

表1 南极磷虾不同部位脂质的脂肪酸组成Tab.1 Fatty acid composition of the lipids from different parts of Euphausia superba %

2.3 脂质组成

如表2所示,南极磷虾脂质成分含有磷脂(phospholipid,PL)、甘油三酯(triglyceride,TG)、甘油二酯(diglyceride,DG)、甘油一酯(monoglyceride,MG)、游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)和胆固醇(cholesterol,CHO)6种,其中PL和TG的质量分数均较高,分别达总脂的40%～50%,其他各种脂类的质量分数均相对较低。胥亚夫等[10]以南极磷虾为原料,采用柠檬酸钠溶液浸泡法提取了南极磷虾油,其磷脂相对质量分数为50.15%,与本研究实验结果一致。

表2 南极磷虾不同部位脂质的脂质组成Tab.2 Lipid class compositions of the lipids from different parts of Euphausia superba %

2.4 不同部位磷脂的分子种轮廓

2.4.1 不同部位磷脂分子种定性分析

采用液相色谱-质谱法(HPLC-MS)对甘油磷脂GPCho和GPEtn进行检测,质谱特征性扫描得到相应磷脂一级质谱图。

通过一级质谱图质量数信息初步鉴定分子种,但由于甘油磷脂sn-1、sn-2位脂肪酸的结构信息未能具体给出,因此需进行二级质谱扫描。根据Yin等[11]的描述推导南极磷虾甘油磷脂GPCho和GPEtn分子种结构。

2.4.2 不同部位磷脂分子种定量分析

采用内标法半定量检测南极磷虾不同部位磷脂分子种,根据一级质谱信号强度计算GPCho和GPEtn分子种相对质量分数,结果见表3和表4。由表3和表4可知,南极磷虾脂质GPCho和GPEtn分子种结构分别有55种和32种。其中,在磷虾全虾、虾肉和虾壳的磷脂中均含有55种GPCho分子,且phosphatidyl 16：0/18：1、16：0/20：5和16：0/22：6最丰富;在磷虾全虾、虾肉和虾壳的磷脂中分别含有20、30和32种GPEtn分子,且phosphatidyl 16：0/18：1、16：0/20：5、16：0/22：6和18：1/20：5最丰富。

表3 南极磷虾不同部位GPCho分子种定量分析Tab.3 Glycerophosphocholines in lipids from different body parts of Euphausia superba %

表4 南极磷虾不同部位GPEtn分子种定量分析Tab.4 Glycerophosphoethanolamines in lipids from different body parts of Euphausia superba %

南极磷虾脂质中大部分GPCho都含有EPA和DHA,南极磷虾脂质中大部分GPEtn也都含有EPA和DHA。陈康等[12]通过鸟枪法鉴定出南极磷虾中共含有36种GPCho分子,其中EPA和DHA脂肪酸链含量占47.75%,是构成磷脂的主要脂肪酸。由此可见,南极磷虾中磷脂的构成脂肪酸主要为EPA和DHA。与甘油三酯形式EPA和DHA相比,磷脂形式的EPA和DHA对机体具有更高的生物利用度[13]。因此在提取南极磷虾磷脂过程中,南极磷虾壳是提取GPCho的最佳原料,而南极磷虾全虾是提取GPEtn的最佳原料。

3 结 论

南极磷虾全虾、虾肉和虾壳的脂质质量分数分别为(14.35±0.06)%、(7.96±0.12)%和(15.52±0.54)%。其中多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的16.52%～20.18%,且以EPA和DHA为主。另外,所有南极磷虾脂质均由磷脂、甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸和固醇酯组成,其中以磷脂和甘油三酯为主,占总脂质的40%～50%。南极磷虾脂质中的磷脂以磷脂酰胆碱(GPCho)和磷脂酰乙醇胺(GPEtn)为主,分别进行定性和定量分析,共得到55种GPCho和32种GPEtn,主要包含的脂肪酸为EPA和DHA。根据含有EPA和DHA的分子种类的数量和含量,南极磷虾壳是提取GPCho的最佳原料,南极磷虾全虾是提取GPEtn的最佳原料。