布鲁氏菌病核酸检测技术研究新进展

党 生，程大伟，刘长民，张 俊，翟景波

（1.内蒙古民族大学医学院，内蒙古 通辽 028043；2.通辽市科尔沁区第一人民医院，内蒙古 通辽 028000；3.北大荒集团总医院，黑龙江 哈尔滨 150040；4.人兽共患病防控自治区高等学校重点实验室，内蒙古 通辽 028000；5.内蒙古自治区布鲁氏菌病防治工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028000）

布鲁氏菌病是通过直接或间接接触受感染的动物或食用其污染的食物传播给人类，在全球范围内每年新增50万例人类布鲁氏菌病病例，代表了世界上最普遍的细菌性人畜共患病［1］。由于布鲁氏菌病可影响人体各个系统、器官，且症状不典型，易被误诊为其他系统疾病［1-2］。因此，及时准确的诊断对于患者尽早采取有效的治疗措施，防止患者错过最佳治疗时期而转为慢性患者，减少疾病对患者造成的痛苦具有重要意义。

目前，临床上布鲁氏菌病的诊断主要依靠血清学检查方法，而血清学诊断是通过检测患者血液中的抗体来间接证明曾接触过该病原体，患者的既往史和接触史，在非自身抗原的识别、免疫处理以及抗体产生模式等方面，不同个体之间有着较大的差异，在感染的“窗口期”，抗体尚未产生，血清学无法达到诊断目的，且布鲁氏菌与沙门氏菌之间存在着交叉抗原，因此，血清学诊断布鲁氏菌病缺乏特异性。布鲁氏菌培养是诊断布鲁氏菌感染的“金标准”，然而，布鲁氏菌生长缓慢，通常需要5~7 d 甚至更长时间进行培养，且阳性率低，因此，结果会造成布鲁氏菌病的延迟诊断；同时，分离培养对实验室要求高，操作不当会造成工作人员的实验室感染。采用更安全、准确、快速的检测方法对于布鲁氏菌病的早期诊断和治疗具有重要意义。

核酸扩增试验（Nucleic Acid Amplification Test，NAAT）具有灵敏度高、特异性强、安全性高、检测时间相对较短、可重复性等优点，使其成为分子生物学研究中应用最为广泛的检测方法，在细菌感染诊断，特别是在那些不可培养和难以培养的微生物引起的感染中不断应用。与其他细菌一样，NAAT用于布鲁氏菌病的诊断势必会取代传统的血清学方法和细菌培养方法。笔者从布鲁氏菌属的基因组学、靶基因的选择、常用引物序列、血液样本在核酸扩增试验中的应用、核酸提取方法、核酸扩增试验等方面对布鲁氏菌病的核酸检测技术进行了综述，以便读者对布鲁氏菌病的核酸检测新技术进行了解。

1 布鲁氏菌属的基因组学

要了解人类布鲁氏菌病的核酸检测技术，首先要知道布鲁氏菌的基因组序列及不同种属对人类的易感性。目前，布鲁氏菌属共计11 种包括6 个经典种：B. melitensis、B. abortus、B. suis、B. canis、B. ovis和B. neotomae；从海洋哺乳动物中分离出来2个种：B. ceti和B. pinnipedialis；3个新种：B. microti、B. inopinata和B. papionis［3］。截至2018年底，已有5株B. melitensis（16M、M28、M5-9、ATCC 23457和NI），4株B. suis（1330、ATCC 23445、VBI22和019），4株B. abortus（S19、9-941、A13334和2308），1株B. ovis（ATCC 25840），2株B. canis（ATCC 23365和HSK A52141），1株B. microtii（CCM 4915），1株B. pinnipedialis（B2/94），尚存在61个该属不同成员的基因组。已经测序的不同种和菌株之间的基因组比较，证实了布鲁氏菌生物体之间染色体大小、核苷酸组成的相似性［4］。除猪种布鲁氏菌生物变种3只有1条3.1 Mb的染色体外，其他种类的布鲁氏菌都有2条约2.1 Mb和1.2 Mb的环形染色体，编码区的比例相似，构成基因的分布相等。相对较大的基因组表明，布鲁氏菌包含了广泛的基因库，使其能够在不同的生态系统内茁壮成长，并感染各种动物宿主。其中，B. melitensis、B. abortus和B. suis会导致人类感染［5］。了解基因组的组成特性，为布鲁氏菌病核酸检测靶基因的选择提供了科学依据。

2 靶基因的选择及常用引物序列

虽然已有较多的关于布鲁氏菌病核酸检测的研究报道，但可用的靶基因并不多见，根据靶基因序列和所选择的核酸扩增方法不同可设计多个不同的引物，见表1。最初被用作布鲁氏菌病NAAT的靶基因是编码外膜蛋白的omp2和omp31［6-7］，但有报道显示，部分B. abortus中存在omp31的缺失使其作为扩增靶基因受到质疑［8］。omp28（bp26）也是布鲁氏菌核酸检测的常用靶基因，有研究将其与omp2和bcsp31进行了比较，其在灵敏度上没有明显优势［9］。16S rRNA在细菌基因组中存在多个副本以及属和物种特定的可变区域，常用作许多细菌感染分子诊断中的靶基因［10-12］，然而，与其他阿尔法变形菌门的交叉反应限制了其在布鲁氏菌病诊断中的应用。插入序列IS711常用于布鲁氏菌病分子诊断［13］，有研究报道IS711在核酸检测时灵敏度更高［14］，这可能与该基因在布鲁氏菌基因组中为多个拷贝相关，研究报道IS711在不同种基因组中的拷贝数在5~13拷贝之间［15］。编码布鲁氏菌属特有的免疫原性膜蛋白31kDa的bcsp31基因［16］，是目前NAAT中检测布鲁氏菌感染最常用的靶基因［5］。

表1 布鲁氏菌病分子诊断中常用的分子靶点和引物Tab. 1 Molecular targets and primers commonly used in molecular diagnosis of brucellosis

3 血液样本在核酸扩增试验中的应用

与传统的培养方法一样，通过NAAT可以在任何临床样本中，如血液、体液、组织液和分泌物中发现布鲁氏菌。因人类布鲁氏菌病是一种系统性感染，因此，外周血是最好的临床检测样本。

3.1 全血样本

由于布鲁氏菌病患者血液中的细菌浓度通常较低［17］，且布鲁氏菌是细胞内寄生菌，因此，最初的研究使用了外周血全血样本以获得最大量的DNA［18］。不幸的是，全血中高浓度的人类基因组DNA以及血红蛋白对Taq聚合酶的强烈抑制作用严重影响了NAAT的性能［19］。

3.2 血清样本

血清样本被认为是核酸扩增试验最理想的样本。然而，从理论上讲，血清中布鲁氏菌DNA浓度少于全血。有研究使用患者血清进行PCR检测，其阳性率高于全血样本，从而打消了这种疑虑［20］，这可能是因为在菌血症期间DNA作为细菌分解产物释放到了血液当中。到20世纪90年代末，许多研究者已经证明，在系统性和局灶性感染的患者血清中都存在可检测到的布鲁氏菌DNA［21-22］。DNA提取程序和扩增过程所用技术的不断改进，表明血清是人类布鲁氏菌病核酸检测的首选样本［23］。

4 核酸提取方法

众所周知，不同的核酸提取方法显著影响着获得DNA 的数量、纯度和完整性，从而影响NAAT 的灵敏度。比较研究表明，不同提取方法所获取的DNA量的差异可达2个数量级。当临床样本中只有少量的目标DNA存在时，核酸提取方法对疾病的诊断尤为重要［24］。NAAT的广泛使用，保证了试剂的标准化和准确性。现已有布鲁氏菌病核酸检测技术试剂盒用于提取DNA，根据所检测样本类型的不同，使用不同的试剂盒。

近年来，已有关于使用布鲁氏菌核酸提取试剂盒检测布鲁氏菌感染的效率的比较研究报道。其中一篇报告研究比较了从已知布鲁氏菌Rev 1 细胞浓度的血清样本中提取DNA 的7 种（UltraClean DNA BloodSpin kit、Puregene DNA purification system、High Pure PCR template preparation kit、Wizard Genomic DNA purification kit、GFX GenomicBlood DNA purification kit、NucleoSpin Tissue kit 和QIAamp DNA Blood minikit）商业核酸提取试剂盒的效率报道［25］。笔者发现，尽管所有测试方案都简单易行，但在DNA回收率、方法的可重复性和污染风险方面存在着很大差异。虽然所有的方案都能提取至少102fg的布鲁氏菌DNA，但使用蛋白水解酶的提取方法是最有效的。除UltraClean 试剂盒外，所有其他试剂盒均表现出一定程度的污染。笔者认为，UltraClean DNA BloodSpin 试剂盒是从血清中提取布鲁氏菌DNA的最有效的方法［25］。

另一项研究评估了5 种（MagNA Pure Compact and MagNA Pure LC instruments、IT 1-2-3 DNA sample purification kit、MasterPure Complete DNA and RNA purification kit、QIAamp DNA blood minikit 和UltraClean microbial DNA isolation kit）商业自动化和手动核酸提取试剂盒的效率，从悬浮在PBS 中或采样拭子中的B. melitensis、B. abortus、B. suis核酸提取方法得出结论，尽管所有评估的方法都能高效地灭活这3种高毒性的布鲁氏菌，DNA的回收率和纯度因样本类型的不同而有所不同［26］。例如，当应用于细菌悬浮液时，MasterPure 试剂盒最为敏感，而MasterPure and MagNA Pure Compact 方法在从拭子样本中提取DNA方面优于前者［26］。

布鲁氏菌血清血细胞同步核酸提取方法［27］与现有的核酸提取方法相比表现出明显的优势。目前，大部分试剂盒采用先裂解后纯化的方法，即先通过对血细胞进行研磨来裂解细胞，然后再运用酚处理进行纯化。然而在研磨的过程中不免会造成红细胞的破坏，真核基因组DNA、血红蛋白及纯化时使用的酚等溶剂均对后续的PCR检测造成干扰，且这些方法并不能确定布鲁氏菌是在血清中还是血细胞中，对于布鲁氏菌病的精准诊断和治疗不能提供有效指导。布鲁氏菌血清血细胞同步核酸提取方法，将血清和血细胞分开提取，考虑到布鲁氏菌寄生在单核细胞内且单核细胞具有黏附性，利用这一特点开发的对血细胞先纯化后裂解的提取技术，对病原菌DNA 提取纯化得更彻底，并且该提取方法能明确布鲁氏菌存在部位，即单纯血清中含有、单纯血细胞中含有或血清血细胞中同时含有，明确布鲁氏菌存在部位在临床诊断以及治疗过程中意义重大。不足之处是血细胞提取所需时间较长，在冲洗过程中会造成部分单核细胞的损失。

总之，目前可用的所有商业试剂盒都能够有效灭活布鲁氏菌，大多数能够有效地从样本中提取布鲁氏菌DNA。考虑到人类布鲁氏菌病临床表现多样，可为局部感染或全身感染，要根据患者的实际情况和样本类型来进一步确定不同样本的最佳提取方案。

5 核酸扩增试验

5.1 普通PCR

使用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行观察，比传统的培养方法检测布鲁氏菌感染更快捷、更敏感，比血清学方法更特异［28］。然而，使用琼脂糖凝胶电泳需要用溴化乙锭等染料对扩增产物进行染色以方便在紫外灯下观察条带，这不仅增加了检测所需时间，且溴化乙锭对人体有致癌作用，这种方法一次所能检测的样本量有限，并且对扩增产物进行开盖处理，会导致产物泄漏，形成气溶胶造成实验室污染。

5.2 PCR-酶免疫分析法（PCR-EIA）

为避免普通PCR的上述缺陷，研究人员开发了一种微孔板格式的PCR-酶免疫分析法（PCR-EIA）［29-30］，这种NAAT方法可避免使用溴化乙锭等有毒化合物对人体造成损害，通过将地高辛标记的扩增产物与扩增子内部互补的生物素化捕获探针进行杂交，在链霉亲和素包被的微量滴度板上捕获，并使用抗地高辛Fab-过氧化物酶偶联物进行检测［31］，其灵敏度约为10 fg，高于普通PCR。此外，对PCR-EIA结果的解释远比普通PCR更客观，该方法可以同时处理多个样品，不需要使用紫外线或在暗室工作［32-33］。

5.3 实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法

尽管引入了普通PCR对人类布鲁氏菌病的检测，随后出现了PCR-EIA，但实时PCR为布鲁氏菌病的核酸检测技术带来了真正的进步，不仅提高了分子检测的灵敏度，而且提高了可重复性，操作简化，能够同时检测多个样本，检测所需时间相对较短，不需要开盖处理，从而减少了产物泄漏污染实验室的可能性，通过标准曲线对样本中细菌载量进行相对定量分析［34-35］，这对繁忙的临床实验室是一个重大的利好。

近年来，开发出许多qPCR 的检测方法，一些人使用DNA 结合染料，如SYBR green I 或EvaGreen，相对简单便宜，但会出现非特异性扩增，一些人则使用附着在寡核苷酸上的荧光团，如：引物探针、水解探针或杂交探针，这些更昂贵，但特异性较强［36］，目前，qPCR技术已在很多国家和地区的临床实验室中得到推广使用。

5.4 多重实时PCR（Multiplex real-time PCR，M-RT-PCR）

M-RT-PCR是1988年由Chamberlain提出，通过在一个反应体系中加入多个引物和探针同时完成对多个目的片段的检测，可在基因突变、分型、疾病的鉴别诊断等多方面得到应用。由于布鲁氏菌病的临床表现是非特异的，与肺外结核病、社区获得性发热综合征、脑膜炎、肉芽肿性肝炎、脓毒性关节炎和椎体骨髓炎等临床表现相似［37］，此时M-RT-PCR是一种很好的选择，因为它能够在一个反应中同时扩增许多相关的物种特异性序列，在疾病的鉴别诊断中具有重要意义，特别是脑膜炎、椎体骨髓炎等病，若诊断延迟，贻误治疗，将导致患者预后不良。M-RT-PCR已被用于快速鉴别诊断布鲁氏菌病和肺外结核病［37-38］，也可在物种水平上鉴定布鲁氏菌病。

5.5 恒温扩增技术

近年来，恒温核酸扩增技术展现了巨大优势，与PCR 相比不需要昂贵的热循环仪，整个反应在恒温条件下进行，且所需时间相对较短。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），是2000 年由日本学者NOTOMI 等［39］发明，使人们摆脱了对PCR 的依赖，但LAMP 的效率取决于靶DNA的大小，在30~200 bp的DNA效果最好，超过500 bp扩增效果较差，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法［40］。重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），是2006年由PIEPENBURG等［41］发明的一种新型恒温核酸扩增技术，该技术包含3种酶：与引物结合的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA酶，在25~42 °C下均有生物活性，可以在短时间恒温条件下对模板DNA进行指数级扩增，在一项研究中报道RPA用于布鲁氏菌病检测中Real-time RPA和侧流层析试纸条（LFD）RPA 的灵敏度和检测限分别为4 个拷贝和6 个拷贝［42］，但RPA 检测的探针设计复杂、费用昂贵。

5.6 数字PCR

数字PCR是第三代PCR技术，是一种全新的绝对定量方法，检测过程由PCR扩增和荧光信号分析两步组成，将反应液稀释到单分子水平后平均分配到数万个单元中进行扩增，扩增结束后对荧光信号进行采集，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0，对样本进行绝对定量，不需要像qPCR做标准曲线来对样本进行相对定量。现有研究报道了数字PCR用于布鲁氏菌病检测，灵敏度可达到单个拷贝，而平行的qPCR检测灵敏度为3.68 fg/反应［43］。但数字PCR也存在一定的缺陷，要对数万个反应单元进行检测，故检测所需时间较长、不适合大量样本的检测，同时价格昂贵，检测成本较高，目前还未应用到临床实验室。

5.7 CRISPR技术

CRISPR技术是根据细菌和古细菌的自然防御机制改编而成，这些生物体利用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白来切割和破坏外部侵略者的DNA以达到抵御病毒和其他异物的攻击。近年来，研究者们发现部分Cas蛋白具有附属切割单链核酸（ssDNA）活性，如Cas12a（Cpf1）、Cas12b、Cas13a、Cas13b等将其应用于核酸检测领域［44］。通常检测反应分为两部分，第一部分是通过等温扩增技术，如：RPA、LAMP、RAA等对目标片段进行扩增，第二部分为CRISPR-Cas检测反应，反应体系中主要成分包含Cas蛋白、Cas蛋白对应的crRNA、荧光报告探针，除此之外，需要检测的目的片段需含有Cas蛋白相对应的PAM序列，crRNA 引导Cas蛋白通过识别PAM序列与目标DNA结合，形成crRNA、Cas蛋白、目标DNA三元复合物，该复合物可对体系内荧光标记的单链核酸产生任意切割，通过收集荧光信号即可达到检测的目的。根据这一发现，2018年Doudna团队开发了一种基于Cas12a的检测系统，即DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter），可对样本中的微量DNA进行快速、简便的检测，利用该系统成功实现了人乳头瘤病毒（HPV）检测［44］。可视化检测对于核酸检测的广泛应用至关重要，同年张锋团队开发了基于Cas13a的“SHERLOCKv2”（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter un-LOCKing Version 2），使用侧流层吸试纸条可裸眼观察颜色变化来判读结果［45］。迄今为止，已经开发了一些基于CRISPR-Cas的方法来检测和诊断传染性和非传染性疾病（如癌症）［46-50］。笔者所在实验室将CRISPR-Cas12a结合RPA技术和核酸检测试纸条用于布鲁氏菌感染的检测，该检测方法的灵敏度高、特异性强，使布鲁氏菌感染的现场核酸检测成为可能。基于CRISPR的检测技术的优点是不需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，恒温条件下即可完成感染病原体的核酸检测，摆脱PCR对变温仪的依赖，将该方法与核酸检测试纸条相结合，可用于患者的床旁检测。

6 小结与展望

布鲁氏菌培养方法虽然费时费力且阳性率低，但对于那些已经确诊的患者进行药敏试验，可以更好地指导临床采取个性化治疗手段，避免抗生素的乱用。血清学方法虽然缺乏特异性，但价格低廉，操作简单，在一些资源贫乏的偏远地区对于布鲁氏菌病的诊断和筛查仍然是最佳的方法学选择。任何形式的NAAT都比传统培养更敏感，比血清学检测更具特异性。鉴于实时荧光定量PCR、数字PCR和CRISPR等检测技术的高灵敏性，阳性检测并不一定意味着活动性感染，可能是在经常暴露的健康人中检测到微小的细菌分解物、非活性生物体DNA 或患者在治疗成功后循环血液中存在的DNA 残留物。因此，应对NAAT所取得的结果进行综合分析，并考虑到所处的临床和流行病学环境。M-RT-PCR检测对布鲁氏菌种类的鉴定和分型，取代了传统的、费力的和危险的表型鉴定方法。通过qPCR和数字PCR对细菌载量进行定量分析，有望在未来用于确定人类布鲁氏菌病治愈的标准。

近年来，基于CRISPR 的核酸检测技术在病原体的核酸检测中展现了巨大的应用前景，通过与恒温扩增技术相结合，已在多种病原体核酸检测领域有研究报道，该方法效率高、操作简单、经济，不需要昂贵的仪器和专业技术人员。CRISPR-Cas系统正在引领一场新的技术革命，尤其为卫生条件相对较差、感染性疾病高发的发展中国家在诊断上带来巨大的技术革命，为人类卫生事业的发展、人民的生命健康作出了积极贡献。