非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

张远龙，王超群，黄育浩，杜 睿，李永福，王自强，李 敏，张险朋

（1.广东省动物疫病预防控制中心，广东广州 510230；2.郑州海关技术中心，河南郑州 450000；3.东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、热性、高度接触性动物传染病[1]。患病猪通常表现出体温升高、全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状。ASF发病快，死亡率很高，给养猪业造成了很大危害，对社会经济影响大。为此，我国将ASF列为一类动物疫病，世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须报告动物疫病。1921年非洲肯尼亚首次暴发ASF，随后该病传入欧洲及美洲[2-3]。2007年，ASF传入高加索地区，并在欧洲东部广泛流行。2009年10月，ASF远距离传入俄罗斯圣彼得堡地区，疫情发生地逐渐靠近我国边境线，引起了我国的高度重视[4]。2018年8月，我国辽宁省沈阳市首先报道了ASF疫情[5]，随后多个省份相继报道疫情，给我国养猪业造成了严重危害[6-7]。

ASFV是一种在细胞质内复制，具有囊膜的双股DNA病毒，属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，该属只有ASFV 1个成员[8]。家猪和欧洲野猪对ASFV非常易感，感染后死亡率最高可达100%，不同年龄、品种和性别的猪对该病毒的易感性无明显差别。ASFV可在野猪体内长期保存，非洲本土的野猪感染该病毒后可能会无临床症状，而是作为储存宿主使病毒在自然界中长期存在[9-10]。ASFV是目前唯一的一种DNA虫媒病毒，广泛分布的蜱类是其重要的储存宿主和传播媒介[11]。

针对ASF，目前尚无有效疫苗和治疗方法[12-14]，其防控措施主要包括对发病场根除净化和对养殖场实施严格生物安全管理措施，其中“早、快、严、小”的防控方案具有很重要意义。ASF诊断主要是根据临床症状、流行病学调查和病理解剖变化等作出初步诊断，然后根据实验室检测结果进行确诊，而实验室检测方法必须快速且结果准确。近年来，数字PCR方法在食品致病菌[15]、动物植物源性成分[16]、遗传疾病临床诊断[17]、感染性疾病诊断[18]等领域得到了广泛应用，也陆续被应用于动物疫病检测方面，先后有猪伪狂犬病[19]、猪圆环病毒2型感染[20]、猪繁殖与呼吸综合征[21]、猪塞内卡病毒病[22]等疫病数字PCR检测方法的报道。本研究以ASFV P72蛋白编码基因（B646L基因）为靶基因设计引物和探针，利用正交试验方法优化反应体系及反应程序，建立了ASFV微滴式数字PCR方法，并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估，以期为预警和防控ASF提供新的检测技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样品 100份猪全血样品，采自东莞市中心生猪定点屠宰场，采用EDTA抗凝，-20 ℃保存；5份ASFV实验室间比对样品，来源于广东省动物疫病预防控制中心。

1.1.2 标准物质和抗原 ASFVB646L基因质粒标准物质，购自哈尔滨元亨生物药业有限公司，标准物质编号为GBW（E）091034，标准值为5 800 copies/μL，扩展不确定度（k= 2）为900 copies/μL。布鲁氏菌抗原、伪狂犬病病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原和猪瘟病毒抗原，购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 主要试剂和仪器 ddPCR Supermix for Probes（no dUTP）试剂盒、ddPCR droplet生成油，购自美国Bio-Rad公司；QIAamp Viral DNA/RNA Mini试剂盒，购自QIAGEN公司；ASFV荧光PCR试剂盒，购自深圳莱孚生物技术公司。PCR仪、QX200微滴数字PCR仪、DG8 cartridge微滴生成芯片、PX1热封仪，购自美国Bio-Rad公司；ABI 7 500荧光PCR仪，购自美国ABI公司。

1.1.4 引物和探针 以ASFVB646L基因为靶向扩增区域，设计微滴式数字PCR引物和探针，引物和探针由上海生工生物工程公司合成。上游引物F：5'-TCTGCAGCTCTTACATACTG-3'；下游引物R：5'-CTTGCTCTGGATACGTTAATA-3'；探针FAM：5'-CCACTACGGAGGCAATGCGATTATT-3'-[black hole quencher（BHQ）]。

1.2 核酸提取

按照QIAamp Viral DNA/RNA Mini试剂盒说明书操作，提取临床样品核酸，-20 ℃保存，备用。

1.3 微滴式数字PCR反应建立

参照ddPCR Supermix for probes（No dUTP）说明书，设计反应体系（表1）及扩增程序，进行微滴式数字PCR操作。试验流程分为4个步骤，包括PCR反应体系配置、微滴制成、普通PCR扩增和扩增微滴数值读取。首先按照表1配置PCR反应体系，模版为ASFVB646L基因质粒标准物质或临床样品所提取的核酸，配置后每个反应体系总体积为20.0 μL。将配置好的每个反应体系加至准备好的微滴生成芯片（DG8 cartridge）中间一排孔中，如果检测的数量不止8个或8的倍数时以控制缓冲液补齐。操作时吸嘴紧贴孔中一侧底部，与孔壁形成一定角度，缓缓把液体打出来，打出一部分反应液时再缓缓提升吸嘴高度，直到打出所有液体，在此操作过程中不能产生气泡。盖上胶垫，将cartridge平稳放置于微滴生成仪中，2～3 min完成微滴生产。微滴生成在cartridge第一排孔中，用移液器缓缓吸取40 μL生成的微滴加入96孔反应板，盖好封膜，放置于PX1热封仪中封膜。封好膜后，将96孔反应板放入PCR仪中进行扩增。反应程序：95 ℃，10 min；94 ℃30 s，58 ℃ 1 min，40个循环；98 ℃10 min，升降温速度≤2.5 ℃/s。PCR扩增完毕后，将96孔反应板放入微滴读取仪中读取结果。

1.4 反应条件优化

利用正交试验方法在1.3基础上进行引物、探针浓度以及退火温度优化。设置不同浓度引物（0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 μmol/L）、不同浓度探针（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μmol/L）以及不同退火温度（51、53、55、57、59 ℃），共3因素5水平25次试验。每个试验重复检测3次。

1.5 特异性试验

分别用DNA/RNA核酸提取试剂盒提取布鲁氏菌、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒以及ASFVB646L基因质粒标准物质核酸，用建立的微滴式数字PCR方法进行检测，分析方法的特异性。同时用NCBI中Blast工具对所选引物进行计算机分析。

1.6 敏感性试验

用无核酸酶水对ASFVB646L基因质粒标准物质进行10倍倍比稀释，共稀释5个梯度。分别用建立的ASFV微滴式数字PCR和ASFV荧光PCR试剂盒进行检测，每个梯度重复检测3次，测定这2种方法的最低检出限，并进行线性分析。

1.7 稳定性试验

用无核酸酶水对ASFVB646L基因质粒标准物质进行10倍稀释，以微滴式数字PCR检测10次，计算检测结果的变异系数，评估该方法的稳定性。

1.8 临床样品检测

用建立的微滴式数字PCR方法和ASFV荧光PCR试剂盒对100份猪全血样品以及5份实验室间比对样品进行检测，分析猪全血样品和实验室间比对样品检测结果的符合率。

2 结果

2.1 微滴式数字PCR检测

微滴式数字PCR检测ASFVB646L基因质粒标准物质的结果为5 880 copies/μL，有效微滴数为16 327个，其中阳性微滴数为16 217个，阴性微滴数为110个（图1）。该检测结果比ASFVB646L基因质粒标准物质的标准值多80 copies/μL，偏差为1.38%，试验结果成立。

图1 ASFV基因质粒标准物质检测结果

2.2 反应条件优化

当反应体系中引物浓度为0.5 μmol/L，探针浓度为0.1 μmol/L，退火温度为59 ℃时，微滴式数字PCR检测可获得最大DNA分子数，且标准偏差较小（SD = 3.40），阴、阳微滴荧光振幅差异明显（图2）。

图2 反应条件优化正交试验结果

2.3 特异性试验

以建立的微滴式数字PCR方法检测布鲁氏菌、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和ASFVB646L基因质粒标准物质核酸，发现生成的有效微滴均在15 000个以上，只有ASFVB646L基因质粒标准物质有特异性扩增，其他病原核酸均为阴性（图3）。使用NCBI中Blast工具，对所选引物进行除ASFV外的多种猪易感病毒核酸序列比对，结果无匹配序列；用Blast工具对所选引物和ASFV基因序列进行比对，发现匹配区域均为编码衣壳蛋白P72的序列，表明建立的方法特异性好。

图3 ASFV微滴式数字PCR方法特异性检测结果

2.4 敏感性试验

将10倍倍比稀释的ASFVB646L基因质粒标准物质进行微滴式数字PCR检测，每个梯度检测3份样品，计算每个梯度的平均值。结果（表2、图4）显示，生成的标准曲线为y= 1.018 2x- 0.037 4，线性相关系数（R²）为0.998 5。建立的ASFV微滴式数字PCR的最低检测限为0.58 copies/μL，而ASFV荧光PCR检测试剂盒的最低检出限为58.00 copies/μL，因此微滴式数字PCR的敏感性是荧光PCR的100倍（表3）。

图4 不同稀释梯度ASFV B646L基因质粒标准物质检测结果及标准曲线

表2 不同稀释梯度B646L基因质粒标准物质检测结果 单位：copies/μL

表3 ASFV微滴式数字PCR与荧光PCR敏感性比较结果

2.5 稳定性试验

用无核酸酶水对ASFVB646L基因质粒标准物质进行10倍稀释，以微滴式数字PCR方法检测10次，结果详见表4、图5。经计算，CV为8.44%，小于15%，表明重复性好。

图5 ASFV微滴式数字PCR方法稳定性试验结果

表4 ASFV微滴式数字PCR稳定性试验结果

2.6 临床样品检测

用建立的微滴式数字PCR方法检测100份猪全血样品，结果均为阴性，与荧光PCR检测结果一致。检测的5份实验室间比对样品中，检测出阳性样品4份，阴性样品1份（表5），与实验室间比对给定的样品盘结果一致。

表5 实验室间比对样品ASFV检测结果

3 讨论

自从我国辽宁省沈阳市发生首例ASF疫情以来，2018—2020年ASF疫情报告最为集中。据统计[23]，2018年10月至2019年9月，我国种猪存栏量连续12个月同比下降超过5%，2020年7月生猪产能稳步下降，猪肉价格同比上涨85.7%。我国是世界上养猪最多的国家，生猪饲养量占全世界一半以上。自从我国发生ASF疫情以来，我国养猪业受到了严重打击，生猪存栏量大幅下降，肉食品供应面临威胁。做好ASF防控，有利于养猪业健康发展，以及猪肉价格稳定。

研究[24]表明，病猪在ASFV感染早期未出现明显临床症状前就已开始排毒。ASFV对外界环境抵抗力较强，在自然条件下，其在各种组织、血液和粪便中可长期保持感染性[25]。因此采用灵敏度高的方法对病毒进行早期检测，做到早发现、早诊断、早处理，对ASF防控意义重大。

目前，ASFV诊断方法包括病毒分离鉴定、免疫荧光抗体试验（FAT）、红细胞吸附试验（HAD）、普通PCR、荧光PCR（qPCR）、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）等。病毒分离鉴定是ASF诊断的金标准，是将样品接种于细胞或试验动物，进行病毒繁殖与分离，然后对分离的病毒进行鉴定。该方法在流行病学溯源、病原检测，以及病毒生物学特性、病毒毒力和疫苗株研究中有很重要的作用，但其对实验室生物安全等级要求高，一般实验室不能开展病毒分离鉴定。FAT、HAD、PCR和LAMP方法等也可用于ASFV检测，在各有优势的同时局限性也十分明显，如操作繁琐、敏感性不足、易交叉污染、易出现假阳性和假阴性结果等诸多问题。最新的RPA方法可在30 min内实现目的基因指数级增长，适合于屠宰场、养殖场和流通环节病毒快速检测，在当前ASF防控中具有重要意义。目前荧光PCR是主流检测方法，在养殖场、屠宰场和各级实验室中得到了广泛应用，但是该方法不能对病毒进行绝对定量检测，且由于敏感性不足无法检出低浓度样本，此外，也易出现假阳性和假阴性结果[26]。数字PCR是近年来兴起的第三代PCR技术，与传统PCR相比，它是一项技术革新，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后以终点法PCR和泊松分布计算样品原始浓度，从而对核酸拷贝数进行绝对定量检测。与荧光PCR相比，数字PCR不用建立标准曲线，敏感性更高，特异性更好，特别是在低浓度样品和机体早期或潜伏期感染诊断更具有优势[27]。

早期研究中，原霖等[28]建立了ASFV微滴式数字PCR方法，并将其应用于临床样品检测，发现其敏感性高于荧光PCR方法。本研究根据ASFVB646L基因设计引物和探针，优化反应条件和反应体系，建立了ASFV微滴式数字PCR方法，其最低检出限为0.58 copies/μL，稳定性试验的变异系数为8.44%，小于15%，重复性好；与布鲁氏菌、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒等猪常见病原体无交叉反应，且在ASFVB646L基因质粒标准物质不同稀释倍数的检测中呈良好的线性关系。利用该方法对临床样品检测未检出阳性样品，原因可能与样品来源于大规模养殖场及样品数量较少有关。在参加广东省动物疫病预防控制中心组织的实验室间比对中，使用本研究建立的微滴式数字PCR方法对比对样品进行检测，其结果与实验室间比对给定的样品盘结果一致。该方法比荧光PCR的敏感性和特异性更高，更适合ASFV早期检测以及低浓度样品如泔水、饲料和猪肉制品等的微量核酸检测，其将在ASF流行病学溯源和防控中发挥重要作用。