甘肃省河西区域牛羊梨形虫病病原及媒介蜱分子流行病学调查

孙 明，任巧云，聂 英，仲富萍，董 伟

（1.民勤县畜牧兽医工作站，甘肃民勤 733999；2.甘肃陇沁现代农牧产业有限公司，甘肃古浪 733100；3.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州 730046；4.武威市畜牧兽医科学研究院，甘肃武威 733000）

梨形虫病是巴贝斯虫病（babesiaosis）和泰勒虫病（theileriosis）的统称，其在世界各地广泛分布，对人畜危害较大[1]。该病在急性期可引起宿主淋巴结肿大、结膜炎、心律加快、食欲不振以及反刍和生产力下降等临床症状，可导致感染宿主1周内死亡；慢性梨形虫病则常见黄疸、贫血、血红蛋白尿和消瘦等临床症状。在自然状态下，梨形虫病病原须通过节肢动物蜱虫进行生物性传播，其自然疫源地与媒介蜱虫分布密切相关。目前在全世界已发现4科21属960种蜱[2]。我国分布有2科10属119种蜱[3]，其中软蜱记录有14种，分布在大陆地区13种、台湾地区3种[4]。我国蜱传疾病在时空上分布不均，主要高发于甘肃、新疆、云南、福建等省份。近年来全球不断有新的蜱传病原体出现，使得蜱传疾病的传播和流行复杂多变。2010年以来，蜱传发热伴血小板减少综合症病毒（SFTSV）和腹地病毒（heartland virus，HRTV）感染已导致30多人死亡。2022年，河南省有多名老人因蜱传“发热伴血小板综合征布尼亚病毒”离世的报道。因此，蜱及蜱媒病不仅影响养殖业的健康发展，也是公共卫生急需解决的问题。

迄今为止，全球已报道17种泰勒虫，包括莱氏泰勒虫（T.lestoquardi）、吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）、尤氏泰勒虫（T.uilenbergi）、绵羊泰勒虫（T.ovis）、隐藏泰勒虫（T.recomdita）、分离泰勒虫（T.separata）、环形泰勒虫（T.annulata）、小泰勒虫（T.parva）、突变泰勒虫（T.mutans）、斑羚泰勒虫（T.taurotragi）、附膜泰勒虫（T.velifera）、安娜泰勒虫（T.annae）、马泰勒虫（T.equi）、鹿泰勒虫（T.cervi）、东方泰勒虫（T.orientalis）、中华泰勒虫（T.sinensis）和山羊泰勒虫（T.hirci）[5-6]。然而，国内仅分离出尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、环形泰勒虫、东方泰勒虫和中华泰勒虫[7-12]。全国记录有16种巴贝斯虫，包括双芽巴贝斯虫（B.bigemina）、牛巴贝斯虫（B.bovis）、大巴贝斯虫（B.major）、莫氏巴贝斯虫（B.motasi）、绵羊巴贝斯虫（B.ovis）、分岐巴贝斯虫（B.divergens）、田鼠巴贝斯虫（B.microti）、柏氏巴贝斯虫（B.perroncitoi）、猪巴贝斯虫（B.trautmanni）、东方巴贝斯虫（B.orientalis）、吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）、犬巴贝斯虫（B.canis）、隐藏巴贝斯虫（B.occultans）、猎户巴贝斯虫（B.venatorum）、卵形巴贝斯虫（B.ovata）和驽马巴贝斯虫（B.caballi）[5-6，13-15]。虽有牛巴贝斯虫病的报道，但引起该病的牛巴贝斯虫在国内尚未被分离到[14]。

河西走廊是甘肃省重要的农业生产区之一，也是沟通我国东部和新疆的主干道，被称为“西北粮仓”，历朝历代均为我国东部通往西域的咽喉要道。发展畜牧业是当地重要的经济收入来源，但由于地处西北，经济发展相对滞后，以及受传统生活方式等因素影响，该区域畜牧养殖方式粗放，动物体表蜱虫寄生严重，梨形虫病广泛流行。本研究以牛羊体表寄生蜱和蜱传梨形虫病病原为研究对象开展调查，以期掌握当地蜱种类、牛羊梨形虫病病原种类及其流行情况，评估蜱及蜱媒病对公共卫生的危害，制定有效防控措施，为促进畜牧业高效健康绿色发展提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体与试剂

感受态细胞、Taq酶、无菌水、X-gal和IPTG，购自宝生物工程（大连）公司；pGEM-T Easy载体，购自Promega公司；DNA提取试剂盒，购自QIAGEN公司；质粒提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）公司。

1.2 基因组DNA

从甘肃省河西五市部分县区采集牛羊抗凝血181份，其中2019年5—7月采集58份（武威市羊抗凝血），2020年4—7月采集123份（武威市牛抗凝血49份、武威市羊抗凝血38份、酒泉市羊抗凝血21份、张掖市抗凝血15份）；2020年4—7月采集蜱虫924只，其中亚洲璃眼蜱699只、草原革蜱94只、波斯锐缘蜱58只、森林革蜱43只、长角血蜱15只、青海血蜱15只。试验选取游离蜱357只。使用QIAGEN公司的基因组提取试剂盒，提取游离蜱虫组织DNA和牛羊抗凝血基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成 参考文献[16-17]，由西安擎科生物技术有限公司合成动物梨形虫病病原巢式PCR通用引物2对：Piro-AS（5'-CCTTCCTTTAAGTGATAAGGTTCAC-3'）和Piro-S1（5'-GACGGTAGGGTATTGGCCTmCCG-3'，m = A + C）；Piro-nestA（5'-ATTACCCAATm-CbGACACvGkGAGG-3'，v = A + C + G，b = T +C + G，k = T + G，m = A + C）和Piro-nest B（5'-TTAAATACGAATGCCCCCAAC-3'）。

1.3.2 18S rRNA基因PCR扩增 以实验室保存的动物梨形虫病病原基因组DNA为阳性对照，未感染牛羊基因组DNA和PCR用水分别为阴性对照和空白对照。PCR扩增反应体系、扩增程序、电泳分析、目的片段与pGEM-T Easy载体连接、LB平板蓝-白斑筛选和菌液鉴定等，均参照文献[18]执行。在380～420 bp位置出现特异性目的条带，经测序分析后判定为梨形虫病病原样品阳性。

1.4 序列分析

将测序获得的基因组DNA，使用BLASTn工具和MEGA v.6.06软件进行比对分析，构建系统发育进化树（Bootstrap，1 000次重复），同时将获得的18S rRNA基因组DNA序列提交GenBank，获得相应的基因序列登录号。

2 结果

2.1 抗凝血样品检测

牛羊抗凝血样品检测结果（表1）显示：经PCR扩增鉴定，检出阳性样品16份，总感染率为8.84%，阳性样品分布于武威市（10.34%）和张掖市（4.76%）。16份阳性样品包括，中华泰勒虫3份、尤氏泰勒虫5份（武威市4份、张掖市1份）、吕氏泰勒虫6份（武威市）、分离泰勒虫1份（武威市，2019年样品）和莫氏巴贝斯虫1份（武威市，2019年样品），酒泉市未检出阳性样品。

表1 牛羊血液样本PCR检测统计结果

2.2 蜱样品检测

蜱样品检测结果（表2）显示：采集的游离蜱涉及硬蜱科的革蜱属、血蜱属和璃眼蜱属，软蜱科的锐缘蜱属。经巢氏PCR扩增测序鉴定，检出携带梨形虫病病原的蜱9只，其中携带中华泰勒虫2只（青海血蜱）、环形泰勒虫1只（亚洲璃眼蜱）、狍泰勒虫1只（亚洲璃眼蜱），双芽巴贝斯虫3只（亚洲璃眼蜱）、隐藏巴贝斯虫2只（亚洲璃眼蜱）；阳性样品全部来源于武威市采集的青海血蜱和亚洲璃眼蜱，蜱病原携带率为3.90%，其余蜱种中未检出阳性样品。

表2 蜱虫样本梨形虫病病原PCR检测统计结果

2.3 序列分析

将扩增测序鉴定的25份梨形虫病病原18S rRNA基因序列提交到GenBank，获得基因序列登录号为MH899756—MH899763，MW404465—MW404480，MW404482。通过BLASTn序列分析，检出3种巴贝斯虫（莫氏巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和隐藏巴贝斯虫）和6种泰勒虫（东方泰勒虫、中华泰勒虫、分离泰勒虫、吕氏泰勒虫、狍泰勒虫和环形泰勒虫）。从构建的进化树（图1）可知，检出的梨形虫病病原分为泰勒虫属和巴贝斯虫属2大类，每种病原跟相应国内外检出虫株同源性均较高，处于各虫株相应分支上，提交序列相似率达99%～100%。

图1 基于梨形虫病病原18S rRNA核苷酸序列系统发育进化树

3 讨论

据文献[19]记载，河西走廊区域分布的泰勒虫属有环形泰勒虫、山羊泰勒虫、绵羊泰勒虫、瑟氏泰勒虫和吕氏泰勒虫，其媒介蜱为缺缘璃眼蜱。其中：瑟氏泰勒虫，其媒介蜱为长角血蜱，主要分布于武威市和张掖市；绵羊泰勒虫，其媒介蜱为青海血蜱，主要分布于河西区域的阴湿和半干旱草原地区，如高台县、民乐县、山丹县、永昌县、肃南县、民勤县等地；吕氏泰勒虫和山羊泰勒虫，在河西五市均有分布。巴贝斯虫属仅有双芽巴贝斯虫在酒泉市和武威市有发现。1997年，罗建勋等[20]对甘肃省13个地区45个县2 168只绵羊和山羊进行羊泰勒虫调查，发现河西五市中除嘉峪关市外其他地区均有感染；孟林明等[21]2011—2012年采集453份羊血液样品进行羊梨形虫病病原检测，在武威市天祝县检测到山羊和绵羊的吕氏泰勒虫阳性率分别为64%和56%，尤氏泰勒虫阳性率分别为58%和56%，在张掖市肃南县、金昌市永昌县和嘉峪关市样品中未检测到阳性样品；李四通等[22]在天祝县11个乡镇350份白牦牛样品中检出中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、双芽巴贝斯虫和环形泰勒虫。本调查采用巢氏PCR检测方法在河西区域共检出1目2科9种梨形虫病病原，包括莫氏巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和隐藏巴贝斯虫3种巴贝斯虫，东方泰勒虫、中华泰勒虫、分离泰勒虫、吕氏泰勒虫、狍泰勒虫和环形泰勒虫6种泰勒虫。从近20年的流行病学调查数据分析，梨形虫病病原在河西走廊区域的感染仍以牧区较为严重，尤其是武威市周边区域，且呈现病原种属多样性特征，这可能与该地区发展对外经济，推进高水平的开放方式息息相关。武威市位于青藏高原、黄土高原和内蒙古-新疆高原之间，北部为干旱气候区，中部为平原绿洲区，南部为祁连山区。祁连山区（天祝县）干燥寒冷，家畜是当地居民的重要肉类和牛奶来源，家畜和野生动物作为梨形虫病病原的天然贮藏宿主，在自然环境中接触媒介蜱虫的概率很高。天祝县的白牦牛已被确认感染过猎户巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫[15，22]。环形泰勒虫，是热带地区泰勒虫病的病原体，由几种璃眼蜱属传播，被认为是对牛最致病的泰勒虫之一[18，23]。该病在武威市的流行主要引起牛奶、肉类以及牛皮等副产品的减产，对当地牛养殖业影响很大。

河西走廊区域发现的硬蜱属蜱虫种类主要有嗜鸟硬蜱（玉门县、嘉峪关市）、草原硬蜱（天祝县、肃北县）、长须血蜱（肃北县）、青海血蜱（天祝县）、阿坝革蜱（天祝县）、银盾革蜱（肃南县）、森林革蜱（肃南县）、短小扇头蜱（肃北县）、小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、亚洲璃眼蜱卡氏亚种、残缘璃眼蜱和盾糙璃眼蜱，软蜱属有拉哈尔钝缘蜱（肃南县、酒泉市、民勤县）和波斯锐缘蜱（酒泉市各县区、民勤县）[19]。2011年，罗晓红等[24]在甘肃省迭部和铧尖地区调查蜱自然感染莱姆病伯氏疏螺旋体的研究成果表明，这些地区硬蜱属、血蜱属和革蜱属分布广泛，是甘肃省蜱类的主要构成者。从地理位置分析，璃眼蜱属、扇头蜱属、锐缘蜱和钝硬蜱属主要分布于河西走廊和祁连山区。2018年，王和平等[25]采用家畜体表检蜱法采集蜱虫并进行形态学鉴定，在武威市、张掖市、酒泉市、嘉峪关市等地共检出蜱类2科3属3种，其中软蜱科1种、硬蜱科2种，波斯锐缘蜱占62.75%（283/451），亚东璃眼蜱占25.49%（115/451），草原革蜱占11.76%（53/451）。本调查在河西走廊区域牛羊体表和环境中共采集蜱虫924份，发现亚洲璃眼蜱占75.65%，草原革蜱占10.17%，波斯锐缘蜱占6.28%，森林革蜱占4.65%，长角血蜱占1.62%，青海血蜱占1.62%，表明硬蜱科种属仍是河西地区的优势蜱种，而亚洲璃眼蜱为河西地区的优势蜱虫，这与王和平等[25]报道的结果一致。特别是亚洲璃眼蜱体内狍泰勒虫、隐藏巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫等病原的检出，提示必须重视环境游离蜱虫的灭蜱工作。

分离泰勒虫首先由Uilenberg和Andreasen（1974年）在坦桑尼亚被发现[26]。Uilenberg和Schreuder发现该病原是通过外翻扇头蜱（Rhipicephalusevertsi）和受感染的绵羊传播的。该病原分布于亚洲，其致病性不强，不会导致绵羊死亡[27]。本调查在武威市采集的羊抗凝血样品中，检出分离泰勒虫阳性样品1份，并发现该阳性样品序列与南非分离到的分离泰勒虫序列（AY260175）相似率达99.1%，这是我国首次在绵羊体内发现分离泰勒虫的存在。关于隐藏巴贝斯虫的描述，目前仅限于非洲撒哈拉以南区域以及尼日利亚和欧洲（例如罗马尼亚）等国家和地区。隐藏巴贝斯虫是一种致病性较弱的病原[5]，宿主为牛，传播媒介为边缘璃眼蜱麻点亚种（Hyalommamarginatm rufipes），分布在非洲，经卵传播，其饥饿雌虫在感染动物体上饱血后繁育而来的次代若虫、成虫均可传播该病原[28]。我国首次在新疆吉木乃县的蜱体内检出该病原[12]。此次调查在靠近内蒙古边境线的武威市采集到的亚洲璃眼蜱虫体内再次检测到隐藏巴贝斯虫，并发现其序列与土耳其（KP745626、KJ000484）、突尼斯（HQ331478）和南非（EU376017）提交的序列相似率达99.0%～100%。此外，莫氏巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、隐藏巴贝斯虫、东方泰勒虫、中华泰勒虫、分离泰勒虫和狍泰勒虫等梨形虫病原都是河西地区新检出虫种，这可能与区域发展牧业经济和活畜的跨区域引种密切相关。由于蜱虫90%的时间是脱离宿主而独立存在的，因而提供了一个良好的环境灭蜱窗口。鉴于梨形虫病对于养羊业、养牛业所造成的危害，建议各地畜牧兽医主管部门加强蜱传播梨形虫病的防治工作。此次流行病学调查结果，将为甘肃省相关部门加强蜱传性血液原虫病的研究和制定有效防控措施提供依据。